&

全基因組甲基化測序技術介紹
*****************************************************************************************************
技術簡介：
全基因組重亞硫酸鹽測序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法，首先通過重亞硫酸鹽對樣本DNA進行處理，將未甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為U堿基，而甲基化的C堿基則不會改變，進行PCR擴增后U堿基會變成T，與原本甲基化的C堿基區(qū)分開，再結合高通量測序技術，可繪制單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。

應用領域：

• 基因表達調(diào)控
• 發(fā)育表觀組學
• 細胞分化、組織發(fā)育

技術優(yōu)勢：

• 可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)
• 可在全基因組水平上最大限度的獲取完整的甲基化信息，精確繪制全基因組甲基化圖譜
• 適用于所有具有參考基因組的物種
• 性價比高，相對于傳統(tǒng)BSP或MSP方法，費用少

技術參數(shù)與實驗流程
*****************************************************************************************************

技術參數(shù)

樣本要求	測序策略	數(shù)據(jù)要求
• 樣品類型： DNA • 樣品需求量：總量>15μg；濃度≥100ng/μL • 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間 • 樣本無明顯降解	• Hiseq 2×150	• 一般建議測序基因組大小的30×數(shù)據(jù)量

實驗流程

A. 建庫測序流程

B. 數(shù)據(jù)分析流程

經(jīng)典文章解讀
*****************************************************************************************************
案例1:多樣本全基因組甲基化測序揭示基因啟動子區(qū)和基因主體區(qū)甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的相互補充作用

背景：啟動子區(qū)DNA甲基化參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但甲基化的程度和表達抑制程度的關系仍不明確；此外，啟動子區(qū)和基因主體區(qū)的甲基化功能相關性也不明確。

方法：Trio家系三個樣本外周血單核白細胞提取RNA和DNA，分別進行轉(zhuǎn)錄組測序和全基因組甲基化測序。

結果：

• 3例樣本總體甲基化模式差別不大。
• 基因表達和甲基化程度呈現(xiàn)明顯的L形狀模式。即極端高表達的基因甲基化程度很低，反之亦然。但是，對于絕大多數(shù)基因來說，甲基化程度和基因表達關聯(lián)性并不高（Pearson correlation = −0.0486, Spearman correlation = 0.0709）。將甲基化區(qū)域拆分成啟動子區(qū)，基因本體區(qū)，或者是外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)，都沒有觀察到顯著的關聯(lián)差異。這些提示我們，DNA甲基化程度與基因表達高低不是簡單的線性相關關系。
• 基于統(tǒng)計模型的構建，提示總體來看DNA甲基化是基因表達水平的指標，但基因本體甲基化程度比啟動子區(qū)甲基化程度的指標作用更佳。
• 統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)或者外顯子區(qū)甲基化存在很少的冗余，即任一區(qū)域的甲基化已經(jīng)足夠引起低表達。
• 研究發(fā)現(xiàn)，整合組蛋白修飾數(shù)據(jù)和甲基化數(shù)據(jù)后，模型的統(tǒng)計效力進一步提升，提示組蛋白修飾和甲基化修飾都不能完全決定對基因表達的調(diào)控。

圖一：基因表達和甲基化程度呈現(xiàn)明顯的L形狀模式。即極端高表達的基因甲基化程度很低，極端低表達的基因甲基化程度很高。

圖二：基于隨機森林的表達模型發(fā)現(xiàn)，對于基因整體表達高低，基因本體甲基化程度比啟動子區(qū)甲基化程度的指標作用更佳

參考文獻：Lou, S., et al., Whole-genome bisulfite sequencing of multiple individuals reveals complementary roles of promoter and gene body methylation in transcriptional regulation. Genome Biol, 2014. 15(7): p. 408.

案例2：番茄果實發(fā)育的單堿基分辨率甲基化譜揭示與成熟相關的表觀修飾

背景：番茄果實的成熟是由植物激素乙烯引發(fā)，但它的影響受一個未知的發(fā)育線索所限制，為了確定這個未知的發(fā)育線索是否涉及表觀遺傳重塑，本研究對番茄用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理，結果發(fā)現(xiàn)果實提前成熟。通過對對果實發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個階段番茄果實進行全基因組甲基化測序，數(shù)據(jù)表明，表觀基因組在果實發(fā)育過程中不能是靜態(tài)的，可能已被選擇用于確保發(fā)育過程的保真度。

方法： 研究人員對果實發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個階段番茄果實（17d，39d，42d，52d），2個成熟缺陷變異株 (Cnr和rin變異) 的成熟期果實和1個野生型番茄葉片進行全基因組甲基化測序，測序深度為10×。

結果：

• 覆蓋了基因組90%的C位點，構建了其表觀基因組圖譜，并揭示其組織和發(fā)育時期的甲基化差異。
• 通過sliding-window的方法掃描4個發(fā)育時期的差異甲基化區(qū)域 (DMR)，共發(fā)現(xiàn)52,095個差異甲基化區(qū)域 (DMR)。
• 通過ChIP-seq分析直接調(diào)控果實成熟基因的轉(zhuǎn)錄因子RIN，結果發(fā)現(xiàn)RIN的結合位點主要位于調(diào)控成熟基因的啟動子的去甲基化區(qū)域，大多位于差異甲基化區(qū)域 (DMR)附近，并且這種結合伴隨去甲基化發(fā)生。

圖一：番茄的表觀基因組圖譜

圖二：不同組織、發(fā)育時期的甲基化差異

圖三： RIN結合位點區(qū)域特征

參考文獻： Zhang S., et al., Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nature biotechnology, 2013 Feb;31(2):154-9.

欧美人妻中文字幕天天弄_久久最新获取地址日韩精品_国内精品久久久精品电影院_999色视频在线观看

全基因組甲基化測序（WGBS）