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人類mRNA測序技術簡介
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技術簡介：
mRNA雖然只占細胞總RNA的3%左右，但由于其最終翻譯成蛋白質(zhì)，參與人類生長、發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展等一系列的生物學過程，一直是研究的焦點。mRNA高通量測序（mRNA-seq）是利用高通量測序技術，對特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的全部mRNA進行測序，全面快速得到基因表達譜變化的同時，還可以通過序列信息精確地分析轉(zhuǎn)錄本的cSNP、可變剪切等序列及結(jié)構(gòu)變異，另外對于檢測低豐度轉(zhuǎn)錄本和發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本具有其獨特的優(yōu)勢。

技術優(yōu)勢

• 開放的全轉(zhuǎn)錄組分析：無需預先設計探針，直接對進行最全面的轉(zhuǎn)錄組分析；
• 準確性高：數(shù)字化信號，直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段的序列；
• 檢測閾值寬：跨越6個數(shù)量級的寬檢測閾值，能同時鑒定及定量正常和稀有的轉(zhuǎn)錄本；
• 分辨率高：可以檢測基因家族中相似基因及可變剪接造成的單堿基差異；
• 信息量大：除表達量外，還提供轉(zhuǎn)錄本的邊界鑒定、RNA編輯、可變剪切、基因融合等信息。

應用領域：

• 快速鑒定不同物種、不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的mRNA及其表達差異
• mRNA編輯分析
• 發(fā)現(xiàn)融合基因；新的mRNA可變剪切；lncRNA分析

技術參數(shù)與實驗流程
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技術參數(shù)

樣本要求	mRNA富集方法	測量平臺	測量數(shù)據(jù)量
a) 樣本類型：完整無DNA污染的Total RNA； b) 樣本起始量 (單次)：≥ 2 μg /樣本； c) 樣本濃度：建議≥ 50 ng/μL； d) 樣本純度：OD260/280 ≥ 1.8； 28S/18S ≥ 1.5； e) 樣本完整度：Agilent 2100 Bioanalyzer RIN值 ≥ 8.0	PolyA富集或者去除核糖體RNA法	Illumina®Hiseq2000 2X150bp測序	每個樣本測序數(shù)據(jù)3G/5G/10G; rRNA比例低于rawdata 的3%

建庫測序流程

數(shù)據(jù)分析內(nèi)容

mRNA-seq生物信息分析內(nèi)容
標準分析	高級分析
原始數(shù)據(jù)整理、過濾及質(zhì)量評估	cSNP分析（需達到10G數(shù)據(jù)量）
參考基因組注釋信息整理	新轉(zhuǎn)錄本預測（需達到10G數(shù)據(jù)量）
比對到參考基因組及結(jié)果評估	可變剪切分析（需達到10G數(shù)據(jù)量）
基因表達量統(tǒng)計	融合基因分析（需達到10G數(shù)據(jù)量）
表達差異基因分析	LncRNA分析（需達到10G數(shù)據(jù)量）
表達差異基因 GO/KEGG 富集分析	個性化分析

經(jīng)典文章解讀
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研究背景：臨床上對于腦溢血（intracerebral hemorrhage，ICH）和缺血性卒中（ischemic stroke，IS）的病人，當病人情況比較危急無法進行影像學檢查時，是很難進行區(qū)分的。因此，準確、便宜、快速的血檢是對于臨床檢測的有效補充。已有文章報道了卒中病人血液轉(zhuǎn)錄組表達量的變化可以作為臨床檢測的biomarker，并進一步闡述了卒中病人血液轉(zhuǎn)錄組調(diào)節(jié)免疫應答的機制，但不同剪切本在卒中病人中的情況并不清楚。

材料與方法：
材料： 為了更精準的實驗設計，本文只選取了白人男性。心源性腦卒中（Cardioembolic IS）、大血管卒中（large vessel）、腔隙性卒中（lacunar）、腦溢血（ICH）病人及正常人對照組各4例，共20例。（表1）
方法： 轉(zhuǎn)錄組測序，只關注不同剪切本。

結(jié)果：

1、412個基因在五組病人/對照組全血樣品轉(zhuǎn)錄組中存在不同的剪切本（differential alternative splicing，DAS），這些基因參與了細胞免疫、細胞因子、細胞死亡、存活等信號通路。
2、由于不同剪切本主要是在剪切過程中選擇不同外顯子造成的，進一步分析發(fā)現(xiàn)，292個基因的308個外顯子在五組病人/對照組中的表達量存在差異。
3、根據(jù)不同外顯子的表達情況，可將五組病人/對照組劃分開：（圖1）
心源性腦卒中（Cardioembolic IS）相關剪切本集中在離子結(jié)合/轉(zhuǎn)運和細胞結(jié)構(gòu)通路中；
大血管卒中（large vessel）相關剪切本集中在細胞死亡、轉(zhuǎn)錄、核染色質(zhì)重塑通路中；
腔隙性卒中（lacunar）相關剪切本集中在細胞應激、循環(huán)、死亡、生存通路中；
腦溢血（ICH）病人相關剪切本集中在蛋白轉(zhuǎn)運和定位通路中。

參考文獻：Dykstra-Aiello C, Jickling G C, Ander B P, et al. Intracerebral hemorrhage and ischemic stroke of different etiologies have distinct alternatively spliced mRNA profiles in the blood: a pilot RNA-Seq study[J]. Translational stroke research, 2015, 6(4): 284-289.

表一

圖一

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RNA高通量測序