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技術(shù)方法：
在實際的研究工作中，依照不同實驗研究的需要，我們可以根據(jù)是否加入標(biāo)準(zhǔn)品來進行絕對定量或者相對定量。目前我們主要可以通過檢測PCR反應(yīng)體系中的熒光強度來實現(xiàn)對初始樣品的某個基因進行定量。根據(jù)檢測熒光來源的不同，常用的實時熒光定量PCR主要分為兩種，一種是通過SYBR Green I嵌入DNA雙鏈發(fā)光原理來實現(xiàn)，而另一種是通過Taqman探針來實現(xiàn)。
1） SYBR Green I
SYBR Green I 是一種結(jié)合于DNA小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料，與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強。在 PCR 反應(yīng)體系中加入SYBR 熒光染料后，在PCR擴增前，由于沒有雙鏈擴增產(chǎn)物DNA的存在，體系中熒光強度很低（雙鏈DNA模板及引物等會產(chǎn)生少量的熒光背景），但隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，體系中的雙鏈DNA不斷增多， SYBR 熒光染料會特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后發(fā)射熒光信號從而使得體系中的熒光強度也同步增加，增加的熒光強度與擴增產(chǎn)物的增加成正比。
SYBR Green I 在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點: 1) 具有通用性，不必因為定位基因的不同而訂購特別探針；2）價格相對較低；3）可以通過熔點曲線分析看擴增產(chǎn)物的特異性，但是由于由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體及非特異擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。
2）TaqMan 探針
TaqMan 探針是一種特殊的寡核苷酸探針，能與待測基因片斷特異結(jié)合，其5’ 端連接一個熒光報告基團，而3’ 則連接有熒光淬滅基團，因此PCR反應(yīng)前，加入的TaqMan 探針不會產(chǎn)生熒光信號，但在PCR過程中，TaqMan 探針會結(jié)合到模板DNA分子上，DNA聚合酶在該DNA分子上延伸碰到結(jié)合著的TaqMan 探針時，其5’ 外切酶活性會將探針切掉，從而使熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，釋放出熒光（見圖IV）。體系中熒光強度與擴增產(chǎn)物等比例增加，這樣用體系中的熒光強度可以很好的代表PCR擴增產(chǎn)物的量。
用Taqman探針來實時檢測PCR擴增的效率具有很強的特異性，對于體系中引物二聚體以及非特異性條帶的產(chǎn)生不太敏感，但是Taqman探針是基因特異性的，不同基因需要訂購合成不同的探針，因此需要耗費較長的訂購時間而且費用也較高。事實上，Taqman探針對目的片斷擴增的特異性檢測并非完全不受引物二聚體或非特異性擴增的影響，在引物二聚體或非特異性擴增發(fā)生的情況下，PCR的擴增效率會顯著下降，從而導(dǎo)致對檢測樣本的目的基因的定量顯著偏低。
 
應(yīng)用領(lǐng)域：
目前基因表達(dá)水平的定量研究在疾病基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、腫瘤研究以及模式生物等多個研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。