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人類全基因外顯子組高通量測序

全基因外顯子組高通量測序
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技術(shù)簡介:
       
全基因外顯子組是基因組全部外顯子區(qū)域的總和,對于人類來說,外顯子組約占基因組的1%。外顯子組測序 (Whole Exome Sequencing,WES)結(jié)合外顯子組富集技術(shù)和二代測序技術(shù),可以高效快速的獲得待測樣品基因組所有已知基因的外顯子及其鄰近區(qū)域的序列及變異。相比于全基因組測序,外顯子組測序更加經(jīng)濟(jì)、高效,數(shù)據(jù)解讀也更加簡單。

應(yīng)用領(lǐng)域:
  •         •  本方法適用于很多的遺傳研究領(lǐng)域,例如疾病基因組研究、腫瘤基因組研究、臨床分子診斷研究等,尤其適合單基因疾病/復(fù)雜疾病致病基因的確定、腫瘤基因組體細(xì)胞突變研究等。
技術(shù)優(yōu)勢:
  •         •  更加直接:外顯子及鄰近區(qū)域是基因功能和調(diào)控最直接的體現(xiàn)!
  •         •  更加經(jīng)濟(jì):以往20個基因外顯子傳統(tǒng)測序經(jīng)費(fèi)就可以成就您的全外顯子組夢想!
  •         •  更加高效:快速完成傳統(tǒng)測序方法無法想象的實(shí)驗(yàn)任務(wù)!
技術(shù)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)流程
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技術(shù)參數(shù)

樣本要求 捕獲平臺 測序平臺 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量
  • 樣品類型:基因組DNA,溶解在H2O或TE (pH 8.0)中。
  • 樣品純度:OD 260/280值應(yīng)在1.8~2.0 之間,無明顯降解與蛋白污染。
  • 樣品濃度:最低濃度不低于50ng/µL.
  • 樣品總量:每個樣品總量>5µg。
Agilent All exon kit V6(捕獲區(qū)域57M)
  • Illumina®Hiseq2000 2X150bp測序
單個樣本5.7G數(shù)據(jù)量;Q30>80%;總測序深度100x(可依據(jù)疾病類型調(diào)整)

 

實(shí)驗(yàn)流程

 
數(shù)據(jù)分析內(nèi)容

基本分析內(nèi)容 高級分析內(nèi)容 單基因病分析內(nèi)容 復(fù)雜疾病分析內(nèi)容 腫瘤分析內(nèi)容 天昊特色分析內(nèi)容
  • 原始數(shù)據(jù)整理、質(zhì)量評估
  • 序列過濾、統(tǒng)計富集效率
  • 參考基因組比對與注釋統(tǒng)計
  • SNV/InDel/CNV檢測,注釋,統(tǒng)計
 
  • 突變位點(diǎn)過濾(數(shù)據(jù)庫過濾,匹配正常樣本過濾)
  • 依據(jù)家系信息進(jìn)行遺傳模式分析
  • 候選致病基因功能注釋
  • 候選致病基因通路富集分析
  • 基于家系連鎖分析
  • 純合區(qū)域策略分析
  • 突變位點(diǎn)過濾(數(shù)據(jù)庫過濾,匹配正常樣本過濾)
  • 依據(jù)家系信息進(jìn)行遺傳模式分析
  • 常見變異的關(guān)聯(lián)分析
  • 罕見變異的基因負(fù)荷檢驗(yàn)
  • 候選致病基因功能注釋
  • 候選致病基因通路富集分析
  • Somatic SNV/InDel/CNV檢測,注釋,統(tǒng)計
  • 不同階段樣本突變譜差異統(tǒng)計
  • 高頻突變基因統(tǒng)計
  • 腫瘤異質(zhì)性/克隆進(jìn)化分析
  • 天昊二代測序數(shù)據(jù)驗(yàn)證試劑盒完成96個SNP分型,分析與二代測序結(jié)果的一致性

經(jīng)典案例解讀
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  • 【癌癥研究】外顯子組測序助力骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS)疾病進(jìn)展相關(guān)驅(qū)動因子研究

研究背景:
  • 骨髓增生異常綜合征(MDS)是一類造血系統(tǒng)腫瘤性疾病,起源于惡性造血干/祖細(xì)胞、具有明顯的異質(zhì)性。其特點(diǎn)是髓系細(xì)胞分化及發(fā)育異常,表現(xiàn)為無效造血、難治性血細(xì)胞減少、造血功能衰竭,高達(dá)30%的MDS患者會向急性髓系白血?。ˋML)轉(zhuǎn)化。MDS疾病進(jìn)展是影響患者生存時間的重大威脅,如何精準(zhǔn)的評估MDS患者的疾病進(jìn)展是一個研究難題,目前正迫切需要確定促進(jìn)MDS疾病進(jìn)展的特異分子事件(驅(qū)動事件)。近年來,NGS及NES測序技術(shù)已成功鑒別部分MDS進(jìn)展相關(guān)突變,如ASXL1、RUNX1、TET2、IDH1、IDH2 和SETBP1突變,但這些與疾病進(jìn)展相關(guān)的突變?nèi)杂写?yàn)證。

研究方法:
圖注:外顯子測序與目的區(qū)域測序研究思路
研究結(jié)果:
  •         •  本研究首先對3名配對疾病進(jìn)展患者的系列骨髓樣本進(jìn)行了全外顯子組和目的區(qū)域測序,試圖發(fā)現(xiàn)與疾病進(jìn)展相關(guān)的體細(xì)胞突變。外顯子組測序共發(fā)現(xiàn)了26個候選突變基因,并且發(fā)現(xiàn)1例病人存在ROBO1體細(xì)胞突變,另 1例病人存在ROBO2體細(xì)胞突變。通過對26個篩查到的候選基因和前期發(fā)現(xiàn)的13個MDS候選基因進(jìn)行目的區(qū)域捕獲測序,最終,在16名配對患者中,有6名(37.5%)患者存在ROBO1和ROBO2體細(xì)胞突變,即是新的疾病進(jìn)展相關(guān)體細(xì)胞突變。通過對包含193名MDS患者進(jìn)行進(jìn)一步的深度測序,檢測出20名(10.4%)患者具有ROBO突變。此外,在疾病進(jìn)展或攜帶ROBO突變的患者中頻繁觀察到有ROBO1和ROBO2存在CNV及雜合度丟失(LOH)。ROBO1突變的患者呈現(xiàn)明顯縮短的生存時間及增加的白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險。 在體外實(shí)驗(yàn)中,研究人員證實(shí)ROBO1和ROBO2是一個抑癌基因,ROBO1或ROBO2突變導(dǎo)致的ROBO/SLIT2信號失活可能推動疾病進(jìn)展。
圖注:26例具有ROBOR突變MDS患者的突變譜
結(jié)論
  •         • 以上研究結(jié)果證實(shí)了ROBO突變對MDS發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn),首次鑒定了ROBO1/2突變是MDS疾病進(jìn)展的驅(qū)動突變,豐富了MDS的突變譜,為研究MDS的疾病進(jìn)展機(jī)制及拓展相應(yīng)的靶向治療提供了新的策略。




 
 
 
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