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RRBS
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技術(shù)簡介：
RRBS測序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，通過酶切富集啟動子及CpG島區(qū)域，并進(jìn)行Bisulfite測序，同時實現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測的高分辨率和測序數(shù)據(jù)的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點，與基因表達(dá)、表型性狀息息相關(guān)。RRBS作為一種高性價比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)優(yōu)勢：

• 可以確定甲基化位點，減少數(shù)據(jù)量，通量較高,單堿基分辨率
• 準(zhǔn)確性高：數(shù)字化信號，直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段的序列

應(yīng)用領(lǐng)域：

• 基因表達(dá)調(diào)控
• 發(fā)育表觀組學(xué)
• 進(jìn)化表觀組學(xué)

技術(shù)參數(shù)與實驗流程
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技術(shù)參數(shù)

樣本要求	文庫類型	測序策略	數(shù)據(jù)要求
樣本類型：基因組DNA 樣品需求量：總量≥5 μg；濃度≥50ng/μL 樣品純度：OD260/280 =1.8~2.0。樣本無明顯降解，無蛋白、RNA污染	200bp 插入片段文庫	Hiseq 2×150	單個樣本數(shù)據(jù)量大于5G，在總數(shù)據(jù)中對于酶切片段目標(biāo)區(qū)域平均測序深度>30X，CpG區(qū)域覆蓋比例>40%。

實驗流程

數(shù)據(jù)分析流程

經(jīng)典案例解讀
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【腫瘤】RRBS測序揭示急性早幼粒細(xì)胞白血病的基因組甲基化水平變化，提示甲基化阻斷了轉(zhuǎn)錄因子與基因組的結(jié)合

研究背景：

腫瘤發(fā)生往往伴有DNA甲基化模式異常。特定的甲基化模式往往和特定的DNA突變相對應(yīng)。急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）疾病進(jìn)程中甲基化變化一直沒有明確的研究結(jié)果。

研究樣本：

18例初次診斷患者（對照：8例復(fù)發(fā)患者密度離心富集骨髓細(xì)胞；4例健康患者的CD34+細(xì)胞； 4例健康患者的CD34+細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化的前骨髓細(xì)胞），PML—RARα轉(zhuǎn)基因小鼠/野生型小鼠骨髓細(xì)胞；逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)造血母細(xì)胞不同時間點的樣品。

研究平臺：

RRBS；Illumina methylation bead array 450K芯片。

研究結(jié)果：

1. 原始甲基化水平數(shù)據(jù)可以將樣本聚類為2類： APL患者為一類，復(fù)發(fā)患者與其它樣品為一類。同時，RRBS的結(jié)果和甲基化芯片結(jié)果具有很好的相關(guān)性（圖一）。
2. 和健康對照相比，APL患者基因組整體甲基化水平主要為中度甲基化（20%-80%），少部分為低甲基化。高甲基化比例和健康對照相差不大。因此，APL患者整體甲基化水平偏高，但染色體末端甲基化程度降低（圖二）。
3. PML-RARalfa結(jié)合位點并不一定是甲基化水平差異位點，提示PML-RARalfa的結(jié)合保護(hù)了結(jié)合位點被過度甲基化（圖三）。
4. 小鼠和細(xì)胞實驗提示，白血病發(fā)病和表型的晚期事件和甲基化變化存在緊密關(guān)聯(lián)。

圖一：基于甲基化水平測序原始數(shù)據(jù)聚類圖顯示樣品的聚類情況。

圖二：相比于健康對照，APL患者基因組越靠近末端的地方，甲基化水平越低。

圖三：APL患者相比于健康對照，PML-RARalfa結(jié)合位點甲基化程度偏低。

研究結(jié)論

• APL疾病發(fā)生伴有DNA高甲基化和整體甲基化水平變異增加，同時染色體末端區(qū)域存在甲基化水平降低。APL疾病中，部分基因組因為DNA甲基化免于被促癌轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，如PML-RARalfa。PML-RARalfa引發(fā)白血病發(fā)生與甲基化水平改變事件是相互獨立的。

• 參考文獻(xiàn)：Schoofs T, Rohde C, Hebestreit K, et al. DNA methylation changes are a late event in acute promyelocytic leukemia and coincide with loss of transcription factor binding.[J]. Blood, 2013, 121(1):178-87.

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