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全基因組甲基化測序技術(shù)介紹
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技術(shù)簡介：
全基因組重亞硫酸鹽測序（whole genome bisulfite Sequencing）是基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法，首先通過重亞硫酸鹽對樣本DNA進行處理，將未甲基化的C堿基轉(zhuǎn)化為U堿基，而甲基化的C堿基則不會改變，進行PCR擴增后U堿基會變成T，與原本甲基化的C堿基區(qū)分開，再結(jié)合高通量測序技術(shù)，可繪制單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。

應(yīng)用領(lǐng)域：

• 基因表達(dá)調(diào)控
• 發(fā)育表觀組學(xué)
• 進化表觀組學(xué)

技術(shù)優(yōu)勢：

• 可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)
• 可在全基因組水平上最大限度的獲取完整的甲基化信息，精確繪制全基因組甲基化圖譜
• 適用于所有具有參考基因組的物種
• 性價比高，相對于傳統(tǒng)BSP或MSP方法，費用少

技術(shù)參數(shù)與實驗流程
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技術(shù)參數(shù)

樣本要求	測序策略	數(shù)據(jù)要求
樣品類型： DNA 樣品需求量：總量>15μg；濃度≥100ng/μL 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間樣本無明顯降解	Hiseq 2×150	一般建議測序基因組大小的30×數(shù)據(jù)量

實驗流程

A. 建庫測序流程

B. 數(shù)據(jù)分析流程

經(jīng)典文章解讀
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案例：早期發(fā)育的玉米種子胚與胚乳的差異轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

背景：番茄果實的成熟是由植物激素乙烯引發(fā)，但它的影響受一個未知的發(fā)育線索所限制，為了確定這個未知的發(fā)育線索是否涉及表觀遺傳重塑，本研究對番茄用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實提前成熟。通過對對果實發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個階段番茄果實進行全基因組甲基化測序，數(shù)據(jù)表明，表觀基因組在果實發(fā)育過程中不能是靜態(tài)的，可能已被選擇用于確保發(fā)育過程的保真度。

方法： 研究人員對果實發(fā)育中從不成熟到完全成熟的4個階段番茄果實（17d，39d，42d，52d），2個成熟缺陷變異株 (Cnr和rin變異) 的成熟期果實和1個野生型番茄葉片進行全基因組甲基化測序，測序深度為10×。

結(jié)果：

• 覆蓋了基因組90%的C位點，構(gòu)建了其表觀基因組圖譜，并揭示其組織和發(fā)育時期的甲基化差異。
• 通過sliding-window的方法掃描4個發(fā)育時期的差異甲基化區(qū)域 (DMR)，共發(fā)現(xiàn)52,095個差異甲基化區(qū)域 (DMR)。
• 通過ChIP-seq分析直接調(diào)控果實成熟基因的轉(zhuǎn)錄因子RIN，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIN的結(jié)合位點主要位于調(diào)控成熟基因的啟動子的去甲基化區(qū)域，大多位于差異甲基化區(qū)域 (DMR)附近，并且這種結(jié)合伴隨去甲基化發(fā)生。

參考文獻(xiàn)： Zhang S., et al., Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nature biotechnology, 2013 Feb;31(2):154-9.

圖一：番茄的表觀基因組圖譜

圖二：不同組織、發(fā)育時期的甲基化差異

圖三： RIN結(jié)合位點區(qū)域特征

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全基因組甲基化測序