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動植物目標區(qū)域測序

目標區(qū)域測序技術(shù)介紹
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技術(shù)簡介：
        目標區(qū)域測序（Targeted Sequencing）：是指針對感興趣的目標區(qū)域富集后進行大規(guī)模測序。研究者可以針對自己感興趣的染色體區(qū)域或者大量的候選基因區(qū)域進行數(shù)百個甚至上千個樣品的序列測定。
 
技術(shù)優(yōu)勢
  •         針對性強：比起全基因組水平的研究，目標區(qū)域測序更具有針對性，可以依賴大量的前期研究成果，獲得候選染色體區(qū)域或者基于生物通路的大量候選基因。
  •         費用低：目標區(qū)域測序區(qū)域較小，可對數(shù)百個樣品進行快速測序，大大降低了研究成本。
  •         信息量大：比起目標區(qū)域或者候選基因單倍型標簽SNP分型的研究策略，目標區(qū)域測序可以完整覆蓋整個基因區(qū)域，不僅可以獲得高頻SNP的分型數(shù)據(jù)，而且還可以發(fā)現(xiàn)低頻的和個體特有的變異。
  •         效率高：比起使用Sanger法的候選基因測序方法，基于二代測序技術(shù)的目標區(qū)域測序更加快速、高效。
  •         高精度：目標區(qū)域的高測序深度保證了更準確的測序結(jié)果，例如目標區(qū)域測序的測序深度可以達到200×。
 
應(yīng)用領(lǐng)域
  •         全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）
  •         QTL定位
  •         輔助育種分子標記開發(fā)
  •         物種分類、系統(tǒng)進化
  •         發(fā)現(xiàn)真正影響目標性狀的功能變異
 
 
 
技術(shù)參數(shù)與實驗流程
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技術(shù)參數(shù)
富集方法 樣本要求 測序策略 數(shù)據(jù)要求
定制液相芯片富集
  • 樣品類型：DNA
  • 樣品需求量：總量>2µg
  • 樣本濃度：不能低于50ng/µl
  • 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間
  • 樣本無明顯降解
  • Hiseq 2×150
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>200×，Q30>80%
Long-PCR富集
  • 樣品類型：DNA
  • 樣品需求量：總量需求 (單個片段需要40ng)
  • 樣本濃度：不能低于20ng/µl
  • 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間
  • 樣本無明顯降解
  • Hiseq 2×150
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>200×，Q30>80%
FastTargetTM富集
  • 樣品類型：DNA
  • 樣品總量：總量需求 (單個Panel需要40ng)
  • 樣本濃度：不能低于20ng/µl
  • 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間
  • Hiseq 2×150
  • Miseq 2×250
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>200×，Q30>80%
EasyTarget ®富集
  • 樣品類型：DNA
  • 樣品總量：總量需求 (單個Panel需要1ug)
  • 樣本濃度：不能低于50ng/µl
  • 樣品質(zhì)量：260/280介于1.7-2.0之間
  • Hiseq 2×150
  • Miseq 2×250
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>200×，Q30>80%
 
 
 
實驗流程
  1. A.    建庫測序流程

  1. 定制液相芯片富集建庫測序流程

  1. Long-PCR富集建庫測序流程

  1. FastTargetTM富集建庫測序流程

  1. EasyTarget ®富集建庫測序流程

  2. B.    數(shù)據(jù)分析流程

 
經(jīng)典案例解讀
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案例1:基于目標區(qū)域測序策略進行奶牛產(chǎn)奶性狀功能基因挖掘

背景： 全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）己經(jīng)廣泛地應(yīng)用于QTL性狀的研究當中，并且定位出了大量顯著的SNP位點，然而這些標記位點并非真正影響目標性狀的功能變異，而可能與功能變異處于連鎖狀態(tài)，因此可以通過對 GWAS 鑒定的區(qū)域進行目標區(qū)域測序，從而找到與QTL性狀緊密相關(guān)的功能變異。

方法： 研究人員前期對中國荷斯坦牛群體進行了產(chǎn)奶性狀的GWAS研究，定位到105個顯著SNP位點，選取6.6Mb的顯著區(qū)段，運用目標區(qū)域捕獲測序（安捷倫Sure select）對60頭公牛進行高通量混池測序（隨機每6頭牛一個文庫）， 測序深度為131×。

結(jié)果： ? 通過目標區(qū)域測序鑒定到127218個SNP，其中735位于編碼區(qū)，418位于UTR區(qū)。 ? 經(jīng)過分析和篩選，選取了200個SNP在來自北京的17個公牛家系和上海的15個公牛家系共734頭母牛上運用質(zhì)譜技術(shù)進行基因分型。 ? 通過對產(chǎn)奶性狀進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)分布在53個基因上的66個SNP與奶牛產(chǎn)奶性狀顯著關(guān)聯(lián)，在這53個基因中，其中26個基因的SNP與前期GWAS結(jié)果一致。 ? 進一步選擇了其中20個顯著基因來分析它們在不同組織中的基因表達水平，發(fā)現(xiàn)15個基因在乳腺中是特異高表達的。

參考文獻：Li Jiang., et al., Targeted resequencing of GWAS loci reveals novel genetic variants for milk production traits. BMC Genomics, 2014 Dec 15;15:1105.
 
 
表一：與奶牛產(chǎn)奶性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP。a: 基于奶牛UMD_3.1 基因組序列. b: MY = 產(chǎn)奶量, FY = 脂肪產(chǎn)量, PY = 蛋白產(chǎn)量, FP =脂肪百分比, PP =蛋白質(zhì)百分比。 *: 這些基因用于基因表達量檢測。
 
圖二：4個泌乳期奶牛的八個組織中基因的相對mRNA表達水平。
 
案例2：基于目標區(qū)域測序策略進行物種分類和系統(tǒng)進化分析

背景：不同鳥類的演化仍然有爭議，需要進行更好的物種分類。

方法：研究人員利用雜交富集的定向測序技術(shù)，對198種現(xiàn)存鳥類（代表所有鳥類譜系和兩個鱷魚外群）的394保守位點進行目標區(qū)域測序，然后基于測序數(shù)據(jù)使用貝葉斯法和最大似然分析法建立所有鳥類譜系的系統(tǒng)進化樹。

結(jié)果： ? 產(chǎn)生259個高質(zhì)量測序核位點（平均長度為1523個堿基）共7.8 × 107 個堿基的數(shù)據(jù)量。 ? 使用貝葉斯法和最大似然分析法建立所有鳥類譜系的進化樹高度一致，5個主要分支形成新鳥綱 (Neoave) 的連續(xù)姐妹類群：（1）包括夜鷹，雨燕和蜂鳥；（2）包括杜鵑，大鴇，鴿子，蕉鵑和沙雞；（3） 鶴及其親屬；（4）水鳥類群，包括潛水類、涉水類、岸灘類；（5）麝雉類。 ? 進化分歧時間與古生物記錄一致，但是不支持最近提出的 “新鳥綱”兩個分支Columbea和Passerea。

參考文獻：Li Jiang., et al., Targeted resequencing of GWAS loci reveals novel genetic variants for milk production traits. BMC Genomics, 2014 Dec 15;15:1105.
 
圖一：鳥類的系統(tǒng)發(fā)育樹
 
 
 
 
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