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ChIP-seq技術(shù)介紹
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技術(shù)簡介：
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力方法，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)或組蛋白特異修飾位點(diǎn)的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。
ChIP-seq的原理是首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChIP)特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對(duì)其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建;然后對(duì)富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。

應(yīng)用領(lǐng)域：

• 反式因子在基因組上結(jié)合位點(diǎn)的精確定位
• 組蛋白共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系

技術(shù)優(yōu)勢：

• 全基因組覆蓋：ChIP-Seq可在全基因組范圍單堿基水平對(duì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)進(jìn) 行篩選與鑒定。
• 高靈敏度：每個(gè)樣本可獲得數(shù)百萬條的序列標(biāo)簽，可發(fā)現(xiàn)研究基因組上稀有的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
• 高精確率：可獲得高水平的信噪比數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確區(qū)分真實(shí)事件與噪音，精確定位蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
高性價(jià)比：僅需較少的數(shù)據(jù)量即可鑒定全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)。

技術(shù)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)流程
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技術(shù)參數(shù)

樣本要求	測序策略	數(shù)據(jù)要求
樣品類型：ChIP富集好的DNA樣品；組織類型：不限；物種信息：不限（有基因組參考序列）；抗體類型：不限（需提供ChIP陽性位點(diǎn)或所用抗體的信息，用于樣品質(zhì)檢和測序數(shù)據(jù)分析。）樣本保存和運(yùn)輸要求：-20°C保存，冰袋運(yùn)輸；樣品總量：單次實(shí)驗(yàn)≥200 ng，請(qǐng)盡可能提供兩次以上的用量；樣品濃度：≥10 ng/µL；樣品純度：OD260/OD280 = 1.8-2.2； DNA片段大?。悍植荚?00-500 bp，主峰分布在200-300 bp；建議提供ChIP獲得DNA設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qPCR定量的檢測報(bào)告，附陽性和陰性對(duì)照的結(jié)果。	Hiseq 2*150	常規(guī)深度：6G clean data；高深度：10G clean data

實(shí)驗(yàn)流程

A. ChIP-seq建庫測序流程

B. 數(shù)據(jù)分析流程

經(jīng)典文章解讀
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案例：利用ChIP-seq鑒定番茄轉(zhuǎn)錄因子ASR1結(jié)合位點(diǎn)

背景：

確定轉(zhuǎn)錄因子的靶基因?qū)τ诮议_所有類型生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是特別重要的。Asr1，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是植物獨(dú)有的，并且廣泛共知它在減輕因?yàn)樗娜狈Χ鸬母珊得{迫方面是起著非常重要的作用。盡管Asr1已經(jīng)被克隆出20多年，但是其靶基因仍然是不清楚的。

方法：

研究人員采集干旱脅迫處理過的番茄葉片（WT），利用Anti-ASR1 抗體進(jìn)行 ChIP-seq；比對(duì)參考基因組，peak calling ；qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)是否準(zhǔn)確；然后對(duì)Peak關(guān)聯(lián)基因在基因組上的位置進(jìn)行分析；對(duì)Peak關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行GO分析；并進(jìn)行ASR1-binding motif預(yù)測。

結(jié)果：

• 通過ASR1抗體富集到5個(gè)顯著的peak區(qū)域(3–830, 9–950, 10–800, 10–810 and 10–820) 。
• 用qPCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)是準(zhǔn)確的，并使用ST-3作為負(fù)對(duì)照。
• ASR1結(jié)合區(qū)域在基因組上的分布發(fā)現(xiàn)42%的結(jié)合區(qū)域位于上游調(diào)控區(qū)，45%位于編碼區(qū)和內(nèi)含子區(qū)，而13%位于下游區(qū)域。
• 對(duì)ASR1富集的靶基因進(jìn)行細(xì)胞功能分類，發(fā)現(xiàn)ASR1富集的靶基因參與編碼細(xì)胞壁的合成和重建以及一些水通道蛋白。
• 確定了一個(gè)ASR1-binding DNA motif。
• 在Asr1-silenced轉(zhuǎn)基因植物中檢測ASR1作用位點(diǎn)（3-200，10-820）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)ASR1被RNAi后，其靶基因的表達(dá)顯著降低，表明靶基因直接受ASR1調(diào)控。

參考文獻(xiàn)
Ricardi MM., et al., Genome-wide data (ChIP-seq) enabled identification of cell wall-related and aquaporin genes as targets of tomato ASR1, a drought stress-responsive transcription factor. BMC Plant Biology, 2014 Jan 14;14:29.

圖一：通過ASR1抗體富集到的peak區(qū)域，并用qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)是否準(zhǔn)確

圖二：ASR1結(jié)合的基因組區(qū)域分析

圖三：確定了一個(gè)ASR1-binding DNA motif

圖四：靶基因的表達(dá)直接受ASR1調(diào)控

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ChIP-seq