|
針對(duì)于樣品DNA總量很少，但無(wú)法再次通過(guò)樣品抽提獲得更多DNA的情況下，我們可以通過(guò)全基因組擴(kuò)增技術(shù)來(lái)增加DNA的總量，使實(shí)驗(yàn)研究可以持續(xù)進(jìn)行。
技術(shù)方法：
全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)是一種對(duì)全基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒(méi)有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量。本公司擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的全基因組擴(kuò)增試劑盒（AmpAll®），該試劑盒主要 利用一種特殊聚合酶，在恒溫下，采用超分支擴(kuò)增模式(圖一)，從少量DNA樣本中均勻、地?cái)U(kuò)增全基因組DNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本全基因組DNA的高產(chǎn)量和高質(zhì)量的均勻擴(kuò)增。該聚合酶具有與模板很強(qiáng)的結(jié)合能力，能在結(jié)合的模板上連續(xù)延伸70kb以上，同時(shí)，這種酶具有3’ —5’外切酶活性，錯(cuò)誤率僅為5 x 10-6，大約比Taq DNA聚合酶低100倍，這保證了序列擴(kuò)增的高保真性。 用該試劑盒進(jìn)行的全基因組擴(kuò)增主要具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)： ●高產(chǎn)量： 10ng (甚至小于1ng) 基因組DNA經(jīng)擴(kuò)增后可產(chǎn)生 >15µg (20µl 反應(yīng)體系) 或 >35 µg（50µl 反應(yīng)體系) 的DNA產(chǎn)物，因此擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)上萬(wàn)倍。 ●高質(zhì)量： 1）全基因組擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度可達(dá)100kb, 平均長(zhǎng)度>10kb (見(jiàn)圖二), 所以該產(chǎn)物可用于克隆，單倍型確定以及長(zhǎng)片斷PCR等實(shí)驗(yàn)。 2）當(dāng)用于擴(kuò)增的DNA模板達(dá)到一定量時(shí)（基因組DNA >10ng 或細(xì)胞數(shù)>600個(gè)），不同基因位點(diǎn)的擴(kuò)增效率相當(dāng)一致，因此擴(kuò)增覆蓋率可接近100%。 3）該試劑盒用的是高保真DNA聚合酶，在擴(kuò)增過(guò)程中，堿基突變引入或短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)復(fù)制滑移發(fā)生的概率非常低，因此該擴(kuò)增產(chǎn)物完全可用于后續(xù)的DNA分析如測(cè)序，SNP和STR分型等。  圖一，超分支擴(kuò)增模式示意圖。首先隨機(jī)引物（橙色）在多個(gè)位點(diǎn)與模板DNA（黑色）配對(duì)， DNA聚合酶隨后在這些位點(diǎn)上同時(shí)開(kāi)始延伸。在延伸過(guò)程中碰到有互補(bǔ)鏈存在時(shí)，該聚合酶將該互補(bǔ)鏈解離模板繼續(xù)延伸。被解離的互補(bǔ)鏈?zhǔn)菃捂?，可以作為新的模板?lái)擴(kuò)增。這樣，一段長(zhǎng)DNA模板在隨機(jī)引物和聚合酶作用下不斷分叉產(chǎn)生新的單鏈模板，形成一個(gè)超分支結(jié)構(gòu)的巨大復(fù)制單元，從而使得該模板不斷得到擴(kuò)增，產(chǎn)生大量高分子量的DNA. 應(yīng)用領(lǐng)域： 該方法涉及到分子生物學(xué)和基因組學(xué)的幾乎所有實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域。
樣本要求：
基因組DNA, 新鮮或干燥的全血，口腔粘膜刮液，發(fā)根和培養(yǎng)的細(xì)胞都可用該試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。樣本用量很少，基因組DNA 5ng即可, 但考慮到DNA定量的偏差或DNA質(zhì)量的樣本間差異等可能影響擴(kuò)增一致性的因素，建議用量>20ng，且。每個(gè)反應(yīng)的模板DNA用量最好大于20ng，模板DNA不能?chē)?yán)重降解，以減少因模板量太少而造成等位基因的不平衡擴(kuò)增。 服務(wù)內(nèi)容：
。
檢測(cè)實(shí)例：
 圖二， 不同樣品的全基因組擴(kuò)增情況。M 是標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA，1是0.1ng DNA，2是1ng DNA, 3是10ng DNA，4是一根發(fā)根，5是口腔粘膜刮液，6是0.2 µl 新鮮血樣。 |
