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MethylTarget中通量目的區(qū)域甲基化水平

技術簡介
       甲基化是一種非常重要的表觀遺傳學標記信息,參與了包括基因調(diào)控、生物發(fā)育、疾病等方方面面,并且在大多數(shù)癌癥中廣泛發(fā)現(xiàn)甲基化異常。除了對于全基因組甲基化水平的觀察與研究,對于眾多目的候選基因的甲基化水平研究則更有針對性和大樣本可行性。使用亞硫酸鹽將DNA進行修飾后,天昊生物結合目的區(qū)域富集和二代測序技術,推出自主研發(fā)的目的候選基因區(qū)域甲基化水平測序技術——MethylTarget,在大幅度降低研究費用的同時實現(xiàn)個性化目的區(qū)域測序檢測(targeted bisulfite sequencing)。



基本原理
技術優(yōu)勢
  •        • 基于二代測序,可以獲得目標區(qū)域內(nèi)所有C的甲基化數(shù)據(jù)。
  •        • ~500×的測序深度,精確計算每個位點C的甲基化程度。
  •        • 通量高,可同時對成百上千個區(qū)域進行甲基化程度分析。
  •        • 適用于大樣本多區(qū)域的DNA甲基化水平檢測。
技術參數(shù)
樣本要求 測序策略 數(shù)據(jù)要求
  • 樣品類型:DNA
  • 樣品需求量:總量>1µug 
    (滿足70個目的片段測序)
  • 樣本濃度:不能低于20ng/µul
  • 樣品質(zhì)量:260/280介于1.7-2.0之間
  • 樣本無明顯降解
  • 測序平臺:Miseq 2×250或2×300(適用于大片段);
  • Hiseq 2×150(適用于較大樣本量和較多片段數(shù)目,比較經(jīng)濟);
  • 測序深度:Miseq 500×;
  • Hiseq 1000×;
Miseq
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>500× 
    Q30>80%,
  • 90%樣本測序深度>350×
  • 平均測序深度>350×的樣本, 
    90%以上的測序片段測序深度大2×
Hiseq
  • 所有樣本目標區(qū)域測序深度平均>1000×, 
    Q30>80%。
  • 90%樣本測序深度>500×。
  • 平均測序深度>500×的樣本 
    90%以上的測序片段測序深度>10×。
實驗流程
 
  1. 建庫測序流程
  1. 數(shù)據(jù)分析流程
經(jīng)典文章解讀
  •        本研究關注兒童注意缺陷多動障礙(ADHD)的甲基化機制。 研究者選取腦組織臨近樣本--唾液DNA為研究樣本。全基因組甲基化芯片確認VIPR2 為ADHD差異候選基因。目的候選基因區(qū)域甲基化水平測序驗證了包括VIPR2在內(nèi)的43個位點, 提示唾液DNA可能被用作精神疾病研究的腦組織替代材料。
  •        Wilmot, B, et al. (2015) Methylomic analysis of salivary DNA in childhood ADHD identifies altered DNA methylation in VIPR2. The Journal of Child Psychology and Psychiatry. Doi: 10.1111/jcpp.12457
  •        研究者采用候選基因區(qū)域甲基化水平測序探究了三個人半乳糖凝集素 編碼基因的甲基化水平在先兆子癇中的作用。結果發(fā)現(xiàn),這些基因內(nèi)的多個關鍵差異甲基化CpG位點與 疾病發(fā)生相關。結合其它研究,研究者指出,這些差異甲基化CpG位點可能影響滋養(yǎng)細胞的半乳糖凝集素 基因簇表達。
  •        Than NG, et al. (2014) Evolutionary origins of the placental expression of chromosome 19 cluster galectins and their complex dysregulation in preeclampsia. Placenta 35 (11):855-865.
  •        研究者采用全基因組甲基化水平測序,結合目的候選基因區(qū)域甲基化水平測序驗證,探究了非洲裔美國人的結腸癌相關甲基化markers 。全基因組檢測明確了13個基因的355個差異甲基化CpG 位點,以及癌癥樣本中的低甲基化長散在重復序列。后續(xù),在42個樣本中對甲基化差異排名前50 的CpGs 位點進行目的區(qū)域甲基化測序驗證,最終明確了非洲裔美國人結腸癌相關的4個甲基化markers: EID3, BMP3, GAS7和GPR75。
  •        Ashktorab, H, et al. (2014) DNA methylome profiling identifies novel methylated genes in African American patients with colorectal neoplasia. Epigenetics. 9(4): 503-512
 
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