|
擴(kuò)增子測序技術(shù)介紹
***************************************************************************************************** 技術(shù)簡介： 擴(kuò)增子測序就是通過對基因組目的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目標(biāo)區(qū)域DNA擴(kuò)增富集后進(jìn)行高通量測序的研究策略。目前擴(kuò)增子測序服務(wù)主要包括細(xì)菌16SrDNA區(qū)/真菌ITS1區(qū)/真菌ITS2區(qū)/真菌18SrDNA區(qū)測序以及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作，可有效研究特定環(huán)境中的物種信息，包括：物種差異、物種分類、物種豐度，對復(fù)雜環(huán)境中的微生物構(gòu)成研究有重要的指導(dǎo)作用。 16S rDNA測序 : 16SrRNA為核糖體的RNA的一個(gè)亞基，16SrDNA就是編碼該亞基的基因，存在于所有細(xì)菌基因組。16S rDNA大小適中，約1.5Kb左右，同時(shí)具有高度的保守性和特異性。16S rDNA既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，目前已被廣泛用于病原菌的檢測和鑒定。 18S rDNA測序 : 18S rDNA為編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列。在結(jié)構(gòu)上分為保守區(qū)和高變區(qū)，保守區(qū)反映生物物種間的親緣關(guān)系，高變區(qū)反映物種間的差異。 ITS 測序: 在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列稱為ITS區(qū)。ITS分為兩個(gè)區(qū)域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。ITS由于是非轉(zhuǎn)錄區(qū)，承受的選擇壓力較小，變異強(qiáng)，目前已廣泛用于真菌分類鑒定。 功能基因測序: 功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到廣泛關(guān)注的一類微生物，如硝化細(xì)菌、反硝化菌、氨氧化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌、固氮菌、固氮菌等。每種功能微生物在分類學(xué)上可能有很大不同，但卻具有相類似的基因使其能夠發(fā)揮同樣的功能，因此使這些功能細(xì)菌發(fā)揮這種特定功能的基因就稱為功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因測序就是針對這些功能基因設(shè)計(jì)PCR通用引物，進(jìn)行建庫高通量測序。 應(yīng)用領(lǐng)域:
技術(shù)優(yōu)勢
技術(shù)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)流程
***************************************************************************************************** 技術(shù)參數(shù)
實(shí)驗(yàn)流程：
經(jīng)典文章解讀
***************************************************************************************************** 案例1：人類，動(dòng)物對南極無冰土壤地區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響 背景：南極具有世界上最極端的環(huán)境，這些極端環(huán)境只支持相對簡單的生態(tài)系統(tǒng)，因此南極生態(tài)系統(tǒng)對外部干擾（如氣候變暖或人活動(dòng)）特別敏感。土壤微生物群落是土壤養(yǎng)分循環(huán)系統(tǒng)的主要驅(qū)動(dòng)因素，它特別容易受到無冰地區(qū)的外部干擾，例如企鵝、海豹。隨著最近幾十年氣候的變暖，冰川融化，出現(xiàn)了新的無冰地區(qū)，因此企鵝、海豹數(shù)量增多，同時(shí)人類在無冰地區(qū)的活動(dòng)也會(huì)對生態(tài)系統(tǒng)造成影響，這些活動(dòng)都會(huì)改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，因此很需要了解人類，動(dòng)物對南極無冰地區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。 方法：為了解人類，動(dòng)物對南極無冰土壤地區(qū)微生物群落的影響，對南極洲菲爾德斯地區(qū)的4種不同土壤樣品（人類、企鵝、海豹影響土壤和原始土壤）進(jìn)行針對16S rRNA rRNA V3高變區(qū)的擴(kuò)增子測序。 結(jié)果：4種土壤樣品的地球化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，在這些樣品中分別鑒定出數(shù)量不同的OUTs（3503 to 4536）；細(xì)菌多樣性由多到少分別是企鵝影響土壤、原始土壤、人類影響土壤、海豹影響土壤。 變形菌，放線菌，酸桿菌，疣微菌存在于所有這4種土壤樣品。在變形菌中豐度最高的是Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria，在放線菌中豐度最高的是放線菌亞綱。 基于距離的冗余分析顯示，PH值、磷、有機(jī)碳、有機(jī)氮是與土壤細(xì)菌群落分布的最重要的相關(guān)因素。 OTU聚類分析顯示，12個(gè)土壤樣品被分為4組，對應(yīng)于4種土壤類型。 維恩圖顯示4種土壤類型中細(xì)菌的OUT有所差異，例如地點(diǎn)特異的OUT數(shù)目變化很大，從海豹影響土壤（3685）到人類影響土壤（5589），只有927個(gè)細(xì)菌OUT是這四種類型土壤所共有的。 對土壤中50個(gè)主要OTUs進(jìn)行熱圖和網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果表明占據(jù)主導(dǎo)地位的50個(gè)OTUs在四種類型土壤中的豐度不同并且在每種類型土壤中占據(jù)主導(dǎo)地位的OTU也不同。 參考文獻(xiàn)：Wang NF et al. Diversity and structure of soil bacterial communities in the Fildes Region (maritime Antarctica) as revealed by 454 pyrosequencing[J]. Front. Microbiol, 2015, 6:1188. 
圖一：(A）南極洲菲爾德斯地區(qū)4個(gè)樣品采集地區(qū)；(B）受人類群體影響的地點(diǎn)（W2）；（C）受海豹影響的地點(diǎn)（36）；（D）受企鵝群體影響的地點(diǎn)（Q11）；（E）原始土壤地點(diǎn)（A1）。
圖二：12個(gè)土壤樣品中細(xì)菌群落基于OTU的聚類分析
圖三：.維恩圖顯示在4種土壤類型中細(xì)菌OTU重疊的程度（在3%的進(jìn)化距離）
圖四：（A）4種類型土壤50個(gè)主要的OTUs的heatmap圖；（B）4種類型土壤50個(gè)主要的OTUs的網(wǎng)狀圖
案例2：人類孕期微生物群落多樣性或提示早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)因素背景：早產(chǎn)發(fā)生在懷孕37周之前，是新生兒死亡的重要原因之一，它折磨著全世界11%的孕婦。20%的早產(chǎn)發(fā)生與羊膜腔內(nèi)細(xì)菌定植有關(guān)，而母親的自身微生物群落是最有可能的羊膜腔內(nèi)細(xì)菌定植來源。美國斯坦福大學(xué)David Relman及其同事提出，懷孕階段的微生物群組成可能提示早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)因素。 方法：研究者采取縱向案例對照研究，選取了49名18歲及以上的孕婦（其中15名孕婦發(fā)生早產(chǎn)），對孕婦每一周以及產(chǎn)后的陰道、大便、唾液和牙齒/牙齦的微生物群落進(jìn)行了采樣。 結(jié)果：通過焦磷酸測序和illumina測序平臺對微生物DNA16S rDNA擴(kuò)增子測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在整個(gè)懷孕期間4種組織來源微生物群組成和多樣性大致保持穩(wěn)定；多數(shù)女性在分娩之后發(fā)生微生物群組急劇而持久的變化，主要表現(xiàn)在乳酸桿菌水平降低以及多種厭氧菌的出現(xiàn)；陰道微生物群落分析表明存在5個(gè)主要微生物群落組成，其中4個(gè)群落都以乳酸桿菌為優(yōu)勢物種，且為不同的乳酸桿菌類型。第5個(gè)群落類型缺乏乳酸桿菌，但是菌種多樣性很豐富；對于某些陰道微生群缺乏乳酸桿菌的女性，加德納菌和脲原體的豐富程度與早產(chǎn)有關(guān)聯(lián)。以上結(jié)果提示，懷孕早期階段的微生物群落多樣性可能為早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)提供線索，并且可能影響產(chǎn)后母親和嬰兒的健康。 參考文獻(xiàn)：Digiulio D B, Callahan B J, Mcmurdie P J, et al. Temporal and spatial variation of the human microbiota during pregnancy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112. 
圖一：懷孕期間4種組織來源微生物群組成和多樣性大致保持穩(wěn)定
圖二：40例孕期女性陰道微生物縱向多樣性分析獲得5個(gè)主要微生物群落組成(CST)。1，2，3，5這四個(gè)群落都以乳酸桿菌為優(yōu)勢物種，且為不同的乳酸桿菌類型。CST 4群落類型缺乏乳酸桿菌，但是菌種多樣性很豐富.
圖三：（A）CST 4群落微生物多樣性豐度程度與早產(chǎn)呈正相關(guān)；（B）CST4樣本所屬孕婦在任一孕期發(fā)生早產(chǎn)的比例都是最高的。
|
