|
英文題目：The Microbiome and Metabolites in Fermented Pu-erh Tea as Revealed by High Throughput Sequencing and Quantitative Multiplex Metabolite Analysis 中文題目：通過高通量測序和定量多重代謝產(chǎn)物分析發(fā)酵普洱茶微生物組及其代謝產(chǎn)物 期刊名：PLoS One 發(fā)表時(shí)間：2016.6 IF：3.057 技術(shù)：真菌ITS1區(qū)擴(kuò)增子測序和細(xì)菌16S V4區(qū)擴(kuò)增子測序 測序平臺：Illumina Miseq測序平臺 材料：7片野茶樹新鮮葉片&31個(gè)普洱茶葉片樣本（15個(gè)生茶&16個(gè)熟茶） 分析方法： • ITS1擴(kuò)增子測序使用UNITE數(shù)據(jù)庫; • 16SV4擴(kuò)增子測序使用Greengenes數(shù)據(jù)庫; • QIIME計(jì)算alpha多樣性(observed richness, Chao 1, Shannon, Simpson Evenness); • PCoA&NMDS分析beta多樣性; • R中vegan軟件包進(jìn)行群落相似差異性分析（Adonis&ANOSIM）; • Venn圖比較組間共有和特異OTU類群; • 使用R中indicspecies軟件包篩選組間代表性物種; • Mantel檢驗(yàn)真菌和細(xì)菌群落組成的潛在相互關(guān)系; 研究背景: 茶在中國是最受歡迎和流行的消費(fèi)飲品之一。常常產(chǎn)自于兩種不同類型的茶樹上，野茶樹和普洱茶樹。根據(jù)不同的處理過程，茶至少分為6中類型：綠茶，黃茶，白茶，紅茶和黑茶。它們當(dāng)中黑茶是最特別地，由于黑茶發(fā)酵過程中微生物的變化，將持續(xù)數(shù)月或者許多年。普洱茶就是黑茶的一種，分為生茶和熟茶的兩種葉片類型。一種是傳統(tǒng)的生茶原始發(fā)酵方式得來稱為生茶，一種是速度較快的熱熟茶的發(fā)酵方式成為熟茶。雖然一些研究已經(jīng)調(diào)查了不同發(fā)酵時(shí)間普洱茶的微生物多樣性，但沒有人研究過新鮮葉片，生茶以及熟茶葉片去微生物群落特征，及細(xì)菌群落和真菌群落組成以及與環(huán)境因子之間的關(guān)聯(lián)性。研究者采集了中國云南的7片野茶樹新鮮葉片和31個(gè)普洱茶葉片樣本（15生茶和16熟茶），旨在解決以下問題：1.鑒別普洱茶中微生物多樣性和組成；2.比較新鮮葉片，自然加工普洱茶以及熟茶普洱茶中的微生物群落結(jié)構(gòu); 3.找出影響普洱茶微生物群落的潛在因素; 4.鑒定出普洱茶中的微生物代謝產(chǎn)物。 研究結(jié)果： 微生物物種豐度和群落組成 通過真菌ITS1區(qū)和細(xì)菌16SV4區(qū)擴(kuò)增子高通量測序，每個(gè)樣本含有超過了42383條真菌ITS序列和29721條細(xì)菌序列。進(jìn)一步去除singleton，Chimera序列以及一些低豐度的OTU序列，得到每個(gè)樣本約39507-214960條真菌序列和66-305472條細(xì)菌序列。通過與其它樣本比較，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和一些生茶茶葉樣本中細(xì)菌序列數(shù)目過少是由于序列中葉綠體序列過多導(dǎo)致（圖1），新鮮葉片中占86.23%（紅色線條），生茶葉片中約占65.81%（藍(lán)色線條），而熟茶葉片中僅有0.09%（橙色線條），這些序列在分析中會被去除。最后去除物種豐度低于0.005%的序列共得到了390個(gè)真菌OTU（每個(gè)樣本65-175個(gè)OTU）和629個(gè)細(xì)菌OTU（每個(gè)樣本18-466個(gè)OTU）。
圖1：葉綠體序列在每個(gè)樣本細(xì)菌序列中的比例。 圖2顯示大多數(shù)真菌物種隸屬于子囊菌門（305個(gè)OTU，91.67%），細(xì)菌物種隸屬于放線菌門（172個(gè)OTU，43.16%），厚壁菌門（220個(gè)OTU，37.01%）和變形菌門（158個(gè)OTU，13.89%）。
圖2：分配到每個(gè)真菌/細(xì)菌門的相對比例。對真菌來說，無論是OTUs (a)還是序列(b)子囊菌門是最豐富的。對細(xì)菌來說，無論是OTUs (c)還是序列(d)放線菌門，變形菌門和厚壁菌門是豐度最高的。 新鮮葉片，生茶和熟茶的普洱茶葉片中微生物群落比較 將三種不同類別的葉片序列通過Venn圖分析發(fā)現(xiàn)（圖3.a&圖3.b），真菌物種中僅1/4（107/390）序列，細(xì)菌物種中僅1/6（107/629）序列為三種不同類別葉片所共有，暗示三種不同類型葉片中微生物群落組成的差異顯著性。從共有OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）共享54%（173/318）的真菌物種和22%（138/625）的細(xì)菌物種，表明新鮮葉片是普洱茶發(fā)酵過程中重要的微生物儲備場所。此外，為篩選出每個(gè)樣本類型中特異OTU對微生物群落的影響，對三種葉片類型的前100個(gè)豐度最高的OTU進(jìn)行Venn圖分析（圖3.c&圖3.d），發(fā)現(xiàn)三種不同類型葉片中共有的真菌和細(xì)菌比例急劇上升。
圖3：新鮮葉片（紅色），生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）的普洱茶Venn圖分析 將不同樣本序列抽頻到相同的序列深度進(jìn)行alpha多樣性預(yù)估（圖4），發(fā)現(xiàn)新鮮葉片（紅色）比生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）的普洱茶葉片有著更多的真菌物種和更少的細(xì)菌物種。
圖4：新鮮葉片（紅色），生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）細(xì)菌（a）和真菌（b）物種豐度的稀釋性曲線分析 真菌中（圖5.a-d），新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）的alpha多樣性指數(shù)（observed species、Chao1、Shannon、Simpson-e）有著顯著性差異，而生茶和熟茶的普洱茶葉片之間均無顯著性差異。細(xì)菌中（圖5.e-h），熟茶的普洱茶葉片中的豐富度比新鮮葉片和生茶的葉片顯著性升高，而香農(nóng)和辛普森指數(shù)未顯著性升高。
圖5：新鮮葉片（紅色），生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）細(xì)菌和真菌的alpha多樣性分析 使用PCoA（圖6）和NMDS（圖7）分析了真菌和細(xì)菌群落Beta多樣性，結(jié)果均顯示出一致性結(jié)果，即在新鮮葉片和普洱茶葉片（生茶和熟茶）之間細(xì)菌群落組成有顯著性差異。有趣的是發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間最老的普洱茶葉片（A6）與熟茶的普洱茶葉片更具有群落相似性，尤其是在真菌群落結(jié)構(gòu)中。且通過ANOSIM和ADONIS分析對群落相似性進(jìn)行檢驗(yàn)（表1），結(jié)果顯示三種不同葉片類型的微生物群落結(jié)構(gòu)均有顯著性差異。
圖6：新鮮葉片（紅色），生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）真菌(a)和細(xì)菌(b)的PCoA分析。藍(lán)色箭頭所指的是發(fā)酵時(shí)間最老的普洱茶葉片（A6，28年）。
圖7：新鮮葉片（紅色），生茶（藍(lán)色）和熟茶（橙色）真菌(a)和細(xì)菌(b)的NMDS分析。
表1：新鮮葉片，生茶和熟茶之間真菌和細(xì)菌的ANOSIM和ADONIS分析。 此外，通過R中indicspecies軟件包在不同類型葉片中篩選出許多指示性物種（表2），發(fā)現(xiàn)熟茶的普洱茶葉片的指示物種為一些嗜熱或者耐熱真菌和細(xì)菌，兩個(gè)指示性物種（曲霉菌和Blastobotrys adeninivorans）在普洱茶葉片（生茶和熟茶）中被發(fā)現(xiàn)，它們可以作為普洱茶葉片中主要的兩大指示性物種，而這個(gè)結(jié)果也被先前的可培養(yǎng)研究和不可培養(yǎng)研究結(jié)果所證實(shí)。
表2：在新鮮葉片，生茶和熟茶中檢測到的真菌/細(xì)菌指示物。 外界因素對普洱茶葉片群落結(jié)構(gòu)變異的影響 研究者調(diào)查了4個(gè)外界因素對普洱茶葉片群落變異的影響，包括時(shí)間，產(chǎn)地，純茶VS污染的茶葉，未壓縮茶葉VS壓縮茶葉等。為了研究葉片發(fā)酵時(shí)間對微生物群落變異的影響，研究者將生茶和熟茶的普洱茶葉片樣本分成兩組（幼葉片和老葉片），或者三組（幼嫩，半老和老葉片）。在上述幾種外界因素中，只有葉片發(fā)酵時(shí)間顯著影響著群落結(jié)構(gòu)，通過ANOSIM和ADONIS分析比較發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間僅僅對生茶造成顯著性影響。熟茶和相對應(yīng)時(shí)間生茶有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時(shí)間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。
表3：ANOSIM和ADONIS分析檢測四個(gè)外界因素對生茶和熟茶真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變異的影響。 Mantel檢驗(yàn)真菌和細(xì)菌群落間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在生茶中真菌和細(xì)菌兩種微生物群落間無相關(guān)性。而16個(gè)熟茶的真菌和細(xì)菌群落之間有顯著性相關(guān)性（P=0.004），當(dāng)去除有其它植物污染的7個(gè)熟茶茶葉樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)熟茶的茶葉真菌和細(xì)菌群落之間也無顯著相關(guān)性。
表4. Mantel檢驗(yàn)生茶和熟茶的真菌和細(xì)菌群落間的相關(guān)性 普洱茶葉片中產(chǎn)毒真菌及其毒素 存在于所有樣本中的15個(gè)最高豐度真菌中有幾個(gè)真菌是產(chǎn)毒真菌，例如尼日爾曲霉、局限曲霉、桔青霉。接著對所有的普洱茶葉片樣本通過LC-MS/MS進(jìn)行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個(gè)化學(xué)物質(zhì)，大多數(shù)化合物濃度都很低。其中5個(gè)在所有的葉片中被發(fā)現(xiàn)，包括:asperglaucide, brevinamide F, emodine, neoechinulin A, andusnic acid等，并且asperglaucide無論是在生茶還是熟茶的葉片中濃度都是最高的。
圖8：生茶（藍(lán)色）和熟茶中真菌毒素檢測。 結(jié)果總結(jié)： 這是一篇比較典型利用miseq測序平臺結(jié)合真菌ITS區(qū)與細(xì)菌16S區(qū)域?qū)ξ⑸锒鄻有砸约叭郝浣M成等展開研究，探究真菌群落與細(xì)菌群落之間的相關(guān)性。適合推薦給真菌與細(xì)菌群落多樣性結(jié)合研究的客戶。 1.群落組成分析：在新鮮葉片和生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片之間細(xì)菌群落組成顯示出顯著性差異。 2. alpha多樣性分析：生茶或者熟茶發(fā)酵的普洱茶葉片真菌群落多樣性降低，細(xì)菌群落多樣性升高。 3. Beta多樣性分析：熟茶和相對應(yīng)時(shí)間生茶的普洱茶葉片有著相似的微生物群落，且與那些發(fā)酵時(shí)間短的生茶葉片有著明顯區(qū)別。 4.外界因素：時(shí)間顯著影響著生茶發(fā)酵的普洱茶葉片，而熟茶則顯示出相反的趨勢。 5.其他分析（如毒素代謝產(chǎn)物檢測）：對茶葉片樣本通過LC-MS/MS進(jìn)行真菌毒素檢測，共發(fā)現(xiàn)了25個(gè)毒素代謝產(chǎn)物，其中asperglaucide酰胺類和棒曲霉素占據(jù)主導(dǎo)地位 。
|
