英文題目:Diagnosing Balamuthia mandrillaris Encephalitis with Metagenomic Deep Sequencing 中文題目:使用宏基因組測序診斷阿米巴原蟲腦炎 期刊名:Annals of Neurology 發(fā)表時間:2015 IF:9.6 技術(shù):宏基因組測序 測序平臺:Illumina HiSeq2500測序平臺(PE135) 材料:一例開始有眼內(nèi)炎,隨后有腦膜炎的74歲女性患者,使用宏基因組測序?qū)ζ淠X脊液(CSF)進(jìn)行鑒定,以確定感染性病原體。 研究背景: 目前診斷腦膜腦炎病因面臨重要的挑戰(zhàn),這是由于各種細(xì)菌,病毒,真菌,寄生蟲,可以產(chǎn)生重疊的臨床表型,常常會延誤診斷和治療。目前許多病原體的特異血清學(xué)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)有檢測昂貴,費時,并有不易操作等缺點,而宏基因組測序可以發(fā)現(xiàn)不常見或新的病毒,因此非常適合用于腦膜腦炎病因的診斷。 病例報告: 病人有過用硫酸羥氯喹治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病史;沒有使用過煙草,酒精,和毒品;在本院治療前4周,病人曾經(jīng)在其它3所醫(yī)療機(jī)構(gòu)治療過,每個機(jī)構(gòu)都診斷其有間歇性發(fā)熱和輕度精神狀態(tài)改變癥狀,在第二個醫(yī)療機(jī)構(gòu)被診斷為眼內(nèi)炎,并用萬古霉素,頭孢他啶和伏立康唑治療過。 使用PCR對單純皰疹病毒,巨細(xì)胞病毒,弓形體病的玻璃狀液檢測結(jié)果呈陰性。腦磁共振結(jié)果顯示有很多的環(huán)形增強(qiáng)和幕上和幕下病變的擴(kuò)散受限,被認(rèn)為符合膿腫以及重度梗阻性腦積水。血液,尿液和腦脊液的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)結(jié)果都是陰性的。腦脊液的神經(jīng)梅毒,肺結(jié)核和隱球菌科的檢測結(jié)果也是陰性(Table1)。弓形蟲病在腦脊液和血清學(xué)的檢查結(jié)果也是陰性。 盡管使用了光譜抗生素,病人的病情惡化,在16天后逐步喪失活動能力和腦干反射能力。在住院的第10天,重復(fù)腰椎穿刺顯示惡化的細(xì)胞增多,同時嗜酸性粒細(xì)胞增多癥更加突出(Table1)。鑒于這些結(jié)果,在住院的第10天停止了廣譜抗生素治療,開始抗結(jié)核和抗真菌治療。第4天的腦活檢沒有明確的診斷,只揭示了有輕微膠質(zhì)細(xì)胞增生和無炎性細(xì)胞或微生物侵入。7天后的第二次腦活檢發(fā)現(xiàn)了病因不明的嚴(yán)重壞死性血管炎,同時伴隨嗜酸性粒細(xì)胞,慢性炎性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增多,但是沒有明顯的肉芽腫性成分。在住院的第14天的重復(fù)腦磁共振成像顯示,病人腦病變的數(shù)量和大小明顯增多,以及基底性腦膜炎的間隔發(fā)展(Fig B,C)。病人日益加重的腦水腫使用高滲性治療和外部排水變得愈加困難。這個患者的血流動力學(xué)最終變得很不穩(wěn)定,這可能是由于顱內(nèi)壓升高,并要求多個升壓藥造成的。病人家屬最終選擇了舒適護(hù)理,病人在住院的第17天去世。
表1:傳染病診斷試驗結(jié)果。 研究結(jié)果: 在腦脊液中鑒定阿米巴原蟲序列 病人樣本的宏基因組測序共產(chǎn)生19,642,962 PE reads,大約有5.2G數(shù)據(jù)。PE reads首先使用PriceSeqFilter進(jìn)行質(zhì)量過濾,然后與人類基因組hg19進(jìn)行比對,沒有比對上人類基因組hg19有33,093條reads,占原始數(shù)據(jù)的0.1%。然后通過和NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫比對確定潛在的病原體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)97%的序列比對上脊椎動物序列和已知的實驗室污染物序列。 過濾完后,發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲是豐度最高的物種,其中81個reads比對上NCBI上3個已知的阿米巴原蟲基因。而一個水對照樣本則沒有發(fā)現(xiàn)可以比對上阿米巴原蟲的序列。使用比對上阿米巴原蟲基因序列的30個reads進(jìn)行組裝,最終生成一個806nt的contig,這個contig能比對上阿米巴原蟲的16S核糖體基因(GenBank accession number KP990616)。 對宏基因組測序結(jié)果進(jìn)行驗證 使用各種方法驗證了阿米巴原蟲的存在。使用PCR在甲醛固定的第二次腦活檢組織、腦脊液、受感染的眼睛玻璃體液鑒定到了阿米巴原蟲的18s核糖體基因。使用病人第二次腦活檢組織更多切片進(jìn)行重新評估,發(fā)現(xiàn)的微生物與血管內(nèi)的阿米巴原蟲相同,并且阿米巴原蟲已經(jīng)延伸到神經(jīng)組織(Fig D)。在疾病預(yù)防控制中心傳染病病理科對腦活檢組織中的阿米巴原蟲進(jìn)行免疫組化檢測(Fig E),發(fā)現(xiàn)了大量活的阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。使用血清學(xué)方法對腦活檢組織中的阿米巴原蟲檢測發(fā)現(xiàn)結(jié)果呈陽性(Table1)。
圖1:神經(jīng)影像學(xué)和神經(jīng)病理學(xué)。(A)軸向T2加權(quán)/液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列(FLAIR)腦磁共振成像(MRI)顯示多個高信號(箭頭),分別對應(yīng)擴(kuò)散加權(quán)成像上的受限擴(kuò)散區(qū)域。(B)軸向T2加權(quán)/液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列(FLAIR)腦磁共振成像(MRI)顯示多個高信號的大小和數(shù)目。(C)增強(qiáng)軸位T1加權(quán)MRI顯示多個環(huán)形強(qiáng)化病變(白色箭頭),基底腦膜炎(黃色箭頭)以及重度腦積水。(D)腦實質(zhì)過碘酸-希夫染色切片顯示了壞死性血管炎,慢性炎性細(xì)胞,和大量類似巨噬細(xì)胞的阿米巴滋養(yǎng)體(箭頭);大多數(shù)的組織顯示一個強(qiáng)烈伴隨混合性炎癥的壞死性血管炎伴,包含了大量巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。(E)免疫組織化學(xué)顯示了大量活的阿米巴原蟲滋養(yǎng)體。 結(jié)果總結(jié): 通過宏基因組測序在腦脊液中鑒定到能比對上阿米巴原蟲核糖體RNA基因的序列。隨后的PCR反應(yīng)確認(rèn)了阿米巴原蟲在腦脊液、腦組織和受感染的眼睛玻璃體液中的存在。血清學(xué)和免疫組化對腦活檢組織中阿米巴原蟲的檢測也呈陽性。因此宏基因組測序是一個功能強(qiáng)大的診斷工具,能夠快速鑒定病原菌,從而為早期靶向治療提供幫助。 文章亮點: 本文患者對血液,尿液和腦脊液通過許多病原體的特異血清學(xué)和PCR檢測結(jié)果均呈陰性,而通過宏基因組測序在腦脊液中則鑒定阿米巴原蟲,這個結(jié)果通過其它方法檢測也得到了驗證,說明宏基因組測序因為可以發(fā)現(xiàn)不常見或新的菌種,因此在腦膜腦炎病因診斷方面有無可比擬的優(yōu)勢。
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