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題目：Carbon constrains fungal endophyte assemblages along the timberline (沿著樹帶界線碳約束的內生真菌群落 )
期刊名： Environmental microbiology 發(fā)表時間：2015.7 IF：5.932 單位：南京中國科學院土壤科學研究所 技術：真菌ITS1區(qū)擴增子測序 測序平臺：454 FLX測序平臺
材料：研究者主要采集位于中國東北地區(qū)吉林省長白山斜坡上的岳樺樹樹葉，采集海拔梯度從1700-2100米的6個采樣地，每個采樣地選取9個樹木樣本，每個數(shù)目樣本采集20片葉片（共1080片，6 Sites * 9 Trees * 20 Leaves）
采集方法：葉片是從每個海拔梯度中隨機選取的每棵當年生樹木枝干的中間部分采集；樣本樹的枝干約高地面1.5m-4.5m（從海拔2076和1630m到1847和1921m）；樹木的枝干一般朝向北部，東南和西南方向；均勻采樣以減少樣本之間的差異性。
分析方法：QIIME計算alpha多樣性，SPSS比較多樣性指數(shù)差異，回歸曲線和pearson相關性，NMDS分析beta多樣性，Cytoscape繪制網絡圖以及R中vegan軟件包進行差異性分析（Adonis/ANOSIM）
研究背景:
植物體內普遍存在著內生菌，主要包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌三大類。樹木和灌木葉片內的內生真菌代表了一類廣泛存在并且高多樣性的真菌類群。目前高通量擴增子測序為研究陸地植物組織真菌多樣性提供了便利條件。成百上千個葉片真菌物種僅僅在一個植物中被發(fā)現(xiàn)，成千上萬個葉片真菌物種在其生長本土范圍內的單一植物種上被發(fā)現(xiàn)。然而，但是關于它們沿著環(huán)境梯度的多樣性模式仍然是不清楚的，另外關于這些復雜的內生真菌群落在相同的宿主種中怎么進行組合的了解也少之又少。
岳樺樹（Betula ermanii）是一種落葉闊葉物種，廣泛分布在陡峭的斜坡上或者北方的森林中，大多位于日本，俄羅斯偏東地區(qū)和中國的東北地區(qū)。研究者采集不同海拔梯度的樹木樣本葉片進行ITS1區(qū)高通量測序，同時對葉片組織的C組成及含量和其它的物理特征進行測量，從而用來比較不同海拔梯度葉片內生真菌群落的alpha和Beta多樣性，以及不同環(huán)境因子對群落組成和分布的影響，并找出驅動群落變異的主要環(huán)境因素，這些群落多樣性和組成變異可以用來反饋或者影響森林生態(tài)系統(tǒng)中的碳循環(huán)和動態(tài)過程。
實驗設計及分析流程圖：
研究結果：
一 數(shù)據(jù)特征
研究者總共采集了54個岳樺樹樣本（1080片葉片），對ITS1區(qū)測序分析共生真菌細菌群落，共得到1079386條序列，每個樣本序列范圍在795-81697條之間，形成了1762個OTU。研究者未去除Singletons(487條，27.64%)，因為它們可能代表了一些稀有的微生物類群。此外，通過去除掉singletons得到的一些的主要結果也并沒有影響觀察到的趨勢。
與一些已有的葉片內生真菌的研究結果相一致，所觀測到的OTU豐富度的稀釋性曲線未能接近于漸近線（Fig S1）。這可能表明了由于采樣或者序列深度問題一些稀有的內生真菌物種沒有被觀測出。盡管如此，岳樺樹或者采樣地點的豐富度是可以比較的。
Fig. S1 所觀測到的OTU豐富度的稀釋性曲線
岳樺樹內生真菌群落中子囊菌占據(jù)主導地位，占總序列的82.73%。此外，非雙核的內生真菌（74條序列）類群也被發(fā)現(xiàn)（Table S1）。在1762個OTU中，15個主要的內生真菌OTUs通過NCBI被比對出，這些序列占據(jù)了所有序列的84.57%（Table S2）。許多假定存在的一些真菌類群也在先前植物研究中發(fā)現(xiàn)，支持了它們潛在的共生能力。
Table S1沿海拔梯度岳樺樹的內生真菌門總結
（包括序列數(shù)目；每個分類序列數(shù)目占總序列數(shù)目的百分比；每個分類單元OTUs的數(shù)目）
Table S2基于比對NCBI得到中國長白山岳樺樹的15個最高豐度OTUs
二 沿海拔梯度多樣性和群落組成差異
研究者發(fā)現(xiàn)種系豐富度隨著海拔高度逐漸遞增（R2 = 0.1774，P = 0.0069），而均勻度僅僅在高海拔位點增加（R2 =0.6859，P < 0.0001；Fig 1）。香農多樣性指數(shù)也隨海拔逐漸增加（R2 = 0.3733，P < 0.0001）。NMDS圖顯示內生真菌群落隨海拔高度在逐漸變化（Fig.2A）。ANOSIM分析結果顯示不同海拔高度的內生真菌群落有著顯著性差異（Table S3）。特別的，隨著海拔梯度升高，擔子菌門相對豐度顯著升高（Fig.3A）。
Fig. 2. 基于計算54個樹樣本×OTU矩陣得到的NMDS圖。每一個點（n = 54）表示單個樹樣本的內生真菌群落。海拔梯度被制成光滑的表面，以適應NMDS排序。
Table S3沿海拔梯度變化內生真菌組成的差異分析
 
Fig. 3. 門水平的分類組成
觀測到的242個區(qū)分明顯的真菌屬，只有62個在所有的海拔梯度中被發(fā)現(xiàn)（Fig 4）。這些共有的位點屬類群作為假定存在的主要屬類群，超過所有序列的98%。此外，在每個海拔梯度上也有特異的一些屬類群，尤其在2076m海拔處，特異屬類群在242個區(qū)分明顯真菌屬中占11.98%。因此，在不同海拔梯度中的內生真菌群落組成差異可以由主要內生真菌物種的相對豐度差異和稀有物種的出現(xiàn)或消失來說明。
Fig. 4. OTU網絡圖顯示屬水平上來自不同海拔的所有樣品OUT之間的相互作用。每一個點代表一個真菌屬（共有242屬）。在左欄中的屬對于一個海拔地點是唯一的，而右欄中的屬隸屬于多個海拔地點。
三 沿海拔梯度植物特征的變化
幾乎所測量植物的一半，包括樹木特征，葉片中基本化學元素成分和葉片碳組分在不同海拔梯度采樣點顯著變化，其中一些表現(xiàn)出明顯的劃分趨勢。岳樺樹樹高，直徑，樹蔭長度和寬度和相鄰樹木密度隨海拔顯示出一個單峰趨勢（Fig S3）。10個基礎元素中，只有C，和Fe含量隨海拔高度變化有顯著性變化。此外，沿海拔梯度變化的四個碳組分含量有顯著性差異（Fig S4） 。木質素含量隨海拔高度增加顯著降低，而半纖維素隨海拔升高緩慢增加，纖維素在高海拔位點含量顯著增加，而可溶性糖類表示出相反趨勢。
Fig. S2 5個測量的樹特征和海拔高度之間的關系
Fig. S3葉中的10個基本元素和海拔高度之間的關系
Fig. S4四個葉中的碳組分和海拔高度之間的關系
四 環(huán)境因子對內生真菌多樣和群落組成差異的影響
研究者發(fā)現(xiàn)海拔梯度與內生真菌多樣性和群落組成顯著相關，以及一些與海拔梯度差有關的一些植物特征變化。這些植物特征或許對所觀測到的Alpha和Beta多樣性有著一定影響。Pearson相關性分析表明，除了海拔梯度，樹木大小，樹葉化學元素和樹葉碳組分可能在不同程度上顯著影響著內生真菌的alpha多樣性。有趣的是發(fā)現(xiàn)葉片碳組分和內生真菌alpha多樣性指數(shù)之間有著強正相關作用，比海拔梯度對均勻度和香農多樣性指數(shù)相關性更強。在四個碳組分中，纖維素和總碳含量對內生真菌alpha多樣性有著相似的作用。盡管當控制海拔梯度因子，物種豐度度和任何測量的植物特征屬性沒有顯著相關性。
此外，Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)（基于Canberra距離）內生真菌的群落組成和環(huán)境因子變異之間顯著相關（pearson相關系數(shù)從高到低排列）：海拔梯度>碳含量>相鄰樹木生長密度>木質素>纖維素>Fe含量>樹高>樹蔭寬度>樹徑。通過R中的vegan軟件包中的bioenv功能，篩選出一系列顯著相關環(huán)境因子，包括海拔梯度，碳含量，樹高，纖維素，木質素和C/N比（Fig 2B）。當控制海波梯度，我們發(fā)現(xiàn)葉片碳含量持續(xù)顯著影響著內生真菌群落組成（r = 0.119, P = 0.01）。此外，樹高和樹蔭寬度與內生真菌群落顯著相關，但是解釋貢獻度值在邊緣（r<0.077）。因此，盡管去除掉海拔梯度的影響，在所有的測量指標中葉片碳含量被認為是對內生真菌alpha和Beta多樣性影響最為顯著的因素（Fig 5）。
Fig. 2B. 基于計算54個樹樣本×OTU矩陣得到的NMDS圖。通過R中的vegan軟件包中的bioenv功能，篩選出與整個菌落最相關的6個環(huán)境因子
Fig. 5.葉片碳含量對岳樺樹葉片內生真菌alpha和Beta多樣性影響。左側：α多樣性指數(shù)（豐富度和均勻度）；右側：葉片碳含量NMDS分析
總體評價：
1研究者采用454測序平臺成本高，樣本測序深度低，建議使用Miseq測序平臺，可獲得更多的序列和節(jié)約成本；
2 研究結果中使用了不同的距離算法進行群落聚類，可考慮使用相同的距離進行比較更加合理。
關于天昊：
天昊生物采用Miseq PE250測序策略對細菌16S rDNA區(qū)/真菌ITS區(qū)/真菌18S rDNA區(qū)的雙V區(qū)或多種單V區(qū)進行測序，使用低循環(huán)數(shù)擴增，保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一；采用特殊方法可有效避免系統(tǒng)內誤差；數(shù)據(jù)質量高，有效序列Q30達到80%以上；加上最新升級的分析內容和解釋詳盡的結題報告，帶您享受極致的微生物擴增子測序體驗。
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