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英文題目：Bovine NK-lysin: Copy number variation and functional diversification 期刊名：PNAS 影響因子：9.674 研究背景： 抗菌肽（AMP）是先天免疫系統(tǒng)的效應分子，它在整個生命周期都廣泛存在。人粒溶素（GNLY）和豬NK-lysin是同源基因，都屬于抗菌肽（AMP），它們在抵抗多種微生物，包括革蘭氏陽性和陰性細菌，真菌，原蟲，病毒，甚至腫瘤細胞都是非常有效的。NK-lysin的同源基因已經(jīng)在許多物種中被鑒定到，包括人，豬，牛，馬和幾種鳥類。在人類及其它大多數(shù)哺乳動物中，NK-lysin是單基因，而牛的NK-lysin是十幾年前第一個被報道的，當時從四種不同奶牛中發(fā)現(xiàn)了兩個NK-lysin cDNA片段（Bo-lysin 89和Bo-lysin 62），但是目前還不清楚這兩個片段是來自兩個不同的NK-lysin基因還是來自同一個NK-lysin基因的等位基因。 拷貝數(shù)變異（CNV）是一種常見的動物基因組結構變異。過去已經(jīng)針對不同品種的牛進行了全基因組CNV分析，其中兩個研究表明，牛NK-lysin基因處于一個CNV區(qū)域。高度一致（90%）的重復（> 1 Kb）被稱為“片段復制”，片段復制在哺乳動物基因組中是非常常見的，它是基因家族擴張的主要機制之一。奶牛基因組測序顯示和人及小鼠一樣奶牛中的許多免疫相關基因拷貝數(shù)也得到擴張，這其中就包括抗菌肽，β-防御素，C型溶菌酶和脂多糖結合蛋白，這些基因家族的擴張可能會產(chǎn)生新的功能基因，從而影響反芻動物胃中的獨特生理或群體環(huán)境中的疾病抵抗能力。 研究材料： 4頭荷斯坦牛；CHORI-240 Bovine BAC文庫；5個組織（肺、胸腺、脾臟、呼吸淋巴結、腸淋巴結） 技術平臺： PacBio RS三代測序，一代測序，qPCR，抑菌實驗 研究思路： 通過NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定到7個不同NK-lysin序列； 系統(tǒng)發(fā)育分析把它們分為4個不同的NK-lysin基因； 克隆測序驗證NK2A, NK2B, NK2C是否真實存在； BAC克隆重測序鑒定?？?個NK-Lysin基因； 鑒定NK-Lysin家族基因組結構和CNV斷點； 一代測序驗證本次得到的 Bo-NK contig精確性； ?？?em>NK-Lysin家族的遺傳結構分析； ?？?em>NK-Lysin家族的重復序列分析； qPCR檢測?？?em>NK-Lysin基因在不同組織中的表達； 牛科NK-Lysin多肽的抗菌效果； 研究結果： 牛科NK-lysin純合性分析 通過尋找NCBI脫氧核苷酸數(shù)據(jù)庫鑒定到7個不同NK-lysin序列，序列的系統(tǒng)發(fā)育分析可以把它們分為4個分支，分別代表4個不同的NK-lysin基因（NK1, NK2A, NK2B, NK2C）（Fig. S1），其中NK1, NK2A, NK2B彼此密切相關，而與NK1有顯著不同。 
Fig. S1. 7個不同NK-lysin序列的系統(tǒng)發(fā)育分析
其中NK1 和 NK2A在?？茀⒖蓟蚪MUMD 3.1中分別被注釋為uncharacterized LOC616323和 Bovine GNLY，這兩個基因在11號染色體上串聯(lián)排列。而NK2B, NK2C在牛參考基因組中是不存在的。為了確認NK2A, NK2B, NK2C的真實性，針對這幾個基因的保守區(qū)設計引物，為了減少等位基因變異在分析中的影響，基于770K HD SNP芯片分型結果選擇了NK-lysin區(qū)域及側翼兩個基因（ATOH8和SFTPB）是純合子的4頭荷斯坦牛（2527, 2796, 2822, 3850）用于下一步的分析。結果從這4個個體中共得到5個不同的序列（Fig. 1），這5個序列形成3個分支，分別對應NK2A，NK2B，NK2C。這3個分支與NK1有明顯的不同。在個體2527中檢測到NK2A的兩條序列，如果個體2527在NK-lysin區(qū)域是純合的，那么在牛中NK2A至少存在兩個拷貝。在個體2822和3850中沒有發(fā)現(xiàn)NK2B相關克隆，并且使用NK2B特異基因引物不能得到其擴增子，說明在這兩個個體中不存在NK2B。
Fig. 1. 在4個純合個體（2527, 2796, 2822, 3850）中進行NK2A, NK2B, NK2C序列分析。對牛的NK-lysin 參考序列（NK1, NK2A, NK2B, NK2C），豬同源序列（Horse-NKL），馬同源序列（Horse-NKL）和來源于4個個體的5個不同克隆序列（Seq. 1–5）進行系統(tǒng)進化分析。
BAC克隆測序鑒定4個NK-Lysin基因通過對覆蓋NK-Lysin區(qū)域的兩個重疊BAC克隆進行測序來確定牛科NK-Lysin家族的精確基因數(shù)目和基因組構成，這兩個BAC克隆分離于CHORI-240 Bovine BAC文庫，然后使用PacBio RS進行測序。通過兩輪測序，平均覆蓋深度達到1310-1551×，因為這兩個文庫有重疊，所以對序列進行了de novo組裝，得到兩個contig，這兩個contig有2 kb的完全重疊區(qū)域。然后這兩個contig被組裝成一個長度227,063 bp，覆蓋整個NK-Lysin區(qū)域的supercontig。這個組裝結果（Bo-NK）要比目前?；蚪M189,124 bp （Bos_taurus_UMD_3.1）的組裝結果長了38 kb，而這個長度上的區(qū)別主要由參考基因組的錯誤組裝引起的。 鑒定NK-Lysin家族基因組結構和CNV斷點 針對本次得到的Bo-NK supercontig 進行散點圖分析，結果發(fā)現(xiàn)了3個具有95%相似性的片段復制（SD-NK2A；SD-NK2B；SD-NK2C），每一個片段復制都包含一個NK-lysin基因，NK1位于NK2C下游41.8 kb ，并且SD-NK2C長度要比SD-NK2A 和 SD-NK2B短，（Fig. 2B）。連接點4（JP-4）序列和其它三個連接點（JP-1，JP-2，JP-3）相比有所不同（Fig. 2C）。 
Fig. 2. PacBio 對BAC 克隆的測序分析。（A） 本次得到的Bo-NK supercontig序列和原來基因組序列 （Bos_taur-us_UMD_3.1.1）的比較結果。錯配 （垂直的藍線）；內(nèi)部重復（灰盒）；4個NK-lysin 基因位置 （箭頭） 。（B） 針對本次得到的 Bo-NK supercontig 進行散點圖分析 。（C）NK-Lysin家族的基因組結構和鑒定到的斷點。JP-2的側翼序列作為參考序列。
一代測序驗證本次得到的 Bo-NK contig精確性為了確定本次得到的Bo-NK contig精確性，在每個連接點（JP）設計引物進行驗證（以CHORI-240 Bovine BAC文庫的供體DNA作為模板），一代測序后發(fā)現(xiàn)JP-1，JP-3，JP-4 的PCR產(chǎn)物與三代測序得到的Bo-NK contig完美一致。 NK-Lysin家族的遺傳結構分析 通過對這4個NK-Lysin的基因組序列進行比對來確定其遺傳結構（Fig.S2）。結果發(fā)現(xiàn)這4個NK-Lysin基因都包含5個外顯子，并且這些外顯子的大小相差不多，但是NK1的內(nèi)含子要大于其它3個基因的內(nèi)含子。NK2A，NK2B，NK2C 相互之間有95%相似性，但是與NK1只有85% 的相似性。通過對這4個NK-Lysin以及人類、豬、馬、羊同源基因編碼序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)只在反芻動物存在NK-Lysin基因家族的擴張。 
Fig. S2. 4個NK-Lysin基因組序列的比對
牛NK-Lysin基因家族的重復序列分析在人類基因家組中，重復序列經(jīng)常是與重組熱點是關聯(lián)的，另外與斷點處重復序列錯配引起的染色體不穩(wěn)定也是相關的。深入分析了NK-Lysin區(qū)域內(nèi)重復元件的分布（Fig. 3A）?？傮w來說每個斷點處下游區(qū)域要比上游區(qū)域具有更多的重復，NK1的側翼序列重復度更高，它包含一個大的長的，分散的細胞核元件（LINES），這與其它3個基因有明顯不同。數(shù)個重復家族位于NK-Lysin區(qū)域內(nèi)，包括2個L1家族，2個LTR家族，4個?？铺禺惖?，短的，分散的細胞核元件（SINE）家族（BOVTA，BTALUL2，CHR-2_BT，CHR-2A）。接著繪制了每個斷點處上游或下游5 kb內(nèi)牛科重復家族的分布圖（Fig. 3B）。JP-1，JP-2，JP-3 下游臨近區(qū)域富集了SINES，特別是BOVTA元件。BOVTA元件組成了一個?？铺禺愔貜图易?，這與人類片段復制相關的ALU重復家族非常類似，表明片段側翼的斷點具有很高的同源性，這有助于減數(shù)分裂時的不平等交換和牛科NK-Lysin基因家族結構的不穩(wěn)定性。 
Fig. 3. 重復元件分析。（A）組裝好的supercontig Bo-NK內(nèi)重復元件的分布，四個斷點和基因如圖所示。（B） 每個斷點處上游或下游5 kb內(nèi)SINEs的分布圖。
?？?/strong>NK-Lysin基因的組織特異性表達為了檢測牛科NK-Lysin基因是否都表達，分別在5個組織（肺、胸腺、脾臟、呼吸淋巴結、腸淋巴結）中檢測了這些基因的表達量。qPCR結果發(fā)現(xiàn)這4個NK-Lysin基因都表達，但是每個基因表達都表現(xiàn)出組織特異性（Fig. 4）：NK1 和NK2A在腸淋巴結高表達但是在肺中低表達；NK2B在各組織中都表達，但在腸淋巴結和肺中高表達；NK2C則在肺中表達量最高。 
Fig. 4. NK-Lysin在肺（L）、胸腺（T）、脾臟（S）、呼吸淋巴結（RLN）、腸淋巴結（IPP）中的基因表達。
?？?/strong>NK-Lysin多肽的抗菌效果使用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌對4種NK-Lysin多肽的抗菌效果進行了測試，這4種NK-Lysin多肽在納摩爾濃度對這兩種菌株的抑菌效果都是有效的（Fig. 5A）。接著使用透射電鏡觀察了NK-Lysin多肽對大腸桿菌細胞膜的作用效果（Fig. 5B），結果發(fā)現(xiàn)沒有經(jīng)過NK-Lysin多肽處理的細胞呈現(xiàn)完整的細胞形態(tài)，例如保持一個完整的細胞膜和充足的細胞質；而經(jīng)過NK-Lysin多肽處理的細胞則呈現(xiàn)周質空間膨脹和細胞質收縮，這表明這4種?？芅K-Lysin多肽具有明顯的抗菌效果。  
Fig. 5. （A） 4種NK-Lysin多肽對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抗菌效果。（B） 透射電鏡觀察NK-Lysin多肽對大腸桿菌細胞的作用效果，（a） 對照細胞；（b）5 μM NK-Lysin多肽處理20分鐘后的細胞。
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