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高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)(HLPA)在流產(chǎn)物中的應(yīng)用
高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)(HLPA)
1、檢測原理
采用連接酶高特異性連接反應(yīng)對目的區(qū)域進(jìn)行雜交、連接，通過專利技術(shù)在連接探針末段引入不同長度的標(biāo)簽序列獲得長度各異的目的探針連接產(chǎn)物，利用熒光標(biāo)記的通用引物對連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熒光毛細(xì)管電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離檢測，最后通過對電泳圖譜的分析獲取各個(gè)位點(diǎn)的峰高，進(jìn)而對樣品目的區(qū)域的拷貝數(shù)進(jìn)行分析。
（圖1 HLPA檢測原理 ）
2、檢測優(yōu)勢• 通量高：可同時(shí)實(shí)現(xiàn)48-480個(gè)區(qū)段拷貝數(shù)快速檢測，檢測效率大大增加。
• 準(zhǔn)確性高：基于高特異性的連接原理，檢測區(qū)域連接產(chǎn)物采用通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增效率基本一致，平均檢測CV<10%。
• 分辨率高：可對6拷貝以內(nèi)的片段進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
• 重復(fù)性高：檢測穩(wěn)定性高，節(jié)約樣品復(fù)孔的檢測費(fèi)用。
• 快速高效：使用的探針短，可以直接合成，無需克隆制備，更快。
高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)（CNVplex®）具有通量高、檢測速度快、準(zhǔn)確度高及價(jià)格低等優(yōu)勢，一經(jīng)上市就受到業(yè)界的廣大好評。在上海國際婦女和平婦幼保健院發(fā)表的一篇關(guān)于CNVplex®技術(shù)用于流產(chǎn)物檢測的文章中提到，CNVplex®對于流產(chǎn)物的檢測結(jié)果與aCGH的結(jié)果完全一致，因此該技術(shù)可作為自然流產(chǎn)后有效的篩查方式。天昊基因目前有二款產(chǎn)品可對流產(chǎn)組織進(jìn)行檢測，分別是染色體非整倍體基因檢測和染色體微缺失微重復(fù)突變檢測。
共設(shè)計(jì)有170對探針，分布在24條染色體的著絲粒兩側(cè)及染色體末端約0Mb, 10Mb, 20Mb處進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，平均每條染色體覆蓋5-8條。該體系可用于檢測每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況，以及染色體的末端缺失或重復(fù)。
（圖2 染色體非整倍體基因檢測探針位置分布圖 ）
√ 染色體微缺失微重復(fù)突變檢測共設(shè)計(jì)有1431對探針，覆蓋了24條染色體的200個(gè)核心區(qū)域以及核心區(qū)域兩側(cè)一定范圍區(qū)域、所有染色體著絲粒兩側(cè)和兩端染色體離末端約0Mb, 10Mb, 20Mb處區(qū)域、以及3個(gè)突變位點(diǎn)（RBM8A ：c.67+32G>C, c.-21delG; FGFR3：c.1138G>A），可對DECIPHER認(rèn)定的70個(gè)綜合征對應(yīng)區(qū)域缺失重復(fù)或點(diǎn)突變位點(diǎn)，ISCA數(shù)據(jù)庫中所有被至少4個(gè)先天系統(tǒng)性發(fā)育異常以及智力發(fā)育遲緩高風(fēng)險(xiǎn)CNV區(qū)段覆蓋的區(qū)域的缺失重復(fù)，以及所有染色體非整倍體及染色體末端缺失重復(fù)進(jìn)行檢測。因此，該體系可用于檢測每條染色體拷貝數(shù)情況，以及對染色體的微缺失微重復(fù)也能進(jìn)行檢測。
（圖2 染色體微缺失微重復(fù)突變檢測探針位置分布圖 ）
1、 由于孕早期自然流產(chǎn)中胚胎染色體異常所致的流產(chǎn)約占50%-70%，因此，自然流產(chǎn)后先進(jìn)行流產(chǎn)胚胎的絨毛染色體檢測是最有可能快速找到流產(chǎn)原因的篩查方法。
若自流流產(chǎn)后不先進(jìn)行流產(chǎn)胚胎染色體檢測，而是先進(jìn)行子宮，免疫，內(nèi)分泌，感染等方面的檢查，能真正查出是這類原因?qū)е碌牧鳟a(chǎn)約不到20%。因此，根本無法解決臨床的需求。另外，流產(chǎn)胚胎如果未經(jīng)檢測就直接丟棄，就有可能丟失先證者，而無法查出真正的流產(chǎn)病因。所以，無論是胎?；驈?fù)發(fā)性流產(chǎn)，對于各種妊娠失敗，如果條件允許時(shí)，均應(yīng)對流產(chǎn)物絨毛或胚胎或胎兒進(jìn)行必要的分子診斷。建議流產(chǎn)物絨毛應(yīng)送檢行染色體CNV檢測。
2、可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)父母的染色體問題，采取合適的生育方式，避免反復(fù)性流產(chǎn)的發(fā)生，避免多次流產(chǎn)錯(cuò)過合適的生育時(shí)機(jī)，給婦女及家庭造成巨大的精神壓力。
通過流產(chǎn)絨毛染色體檢測的不同結(jié)果類型，可反推出是胚胎自發(fā)突變導(dǎo)致的染色體異常還是由于父母是染色體異常攜帶者導(dǎo)致的胚胎染色體異常。從結(jié)果可反推出多種父母染色體異常攜帶者的類型如：平衡易位、羅伯遜易位、倒位等。
3、如果每次流產(chǎn)的胚胎染色體異常并不是都一樣，而是存在多個(gè)染色體問題，可查找夫妻雙方是否存在減數(shù)分裂相關(guān)的基因突變。
4、隨著現(xiàn)代基因檢測技術(shù)的進(jìn)步，新技術(shù)、新方法層出不窮被逐漸應(yīng)用于臨床，檢測費(fèi)用也在不斷降低，絕大部分普通家庭都可以承受。
基于以上這些原因，越來越多的專家認(rèn)為流產(chǎn)后進(jìn)行胚胎絨毛染色體分析對于臨床是非常有必要的，流產(chǎn)胚胎絨毛的檢測不僅能為臨床評估孕婦下一次的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提供遺傳建議及治療方案，還能在一定程度上減輕流產(chǎn)孕婦緊張焦慮的情緒，有助于下一次的備孕。而天昊基因的高通量連接探針擴(kuò)增技術(shù)(HLPA)是流產(chǎn)組織檢測的首選。
