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天昊CNVPlex®技術(shù)應(yīng)用于自發(fā)性流產(chǎn)的遺傳學(xué)診斷
胎兒染色體數(shù)目異常是引起自發(fā)性流產(chǎn)的最重要原因,主要發(fā)生機制是配子減數(shù)分裂過程中隨機性的發(fā)生染色體不分離。此外,若父母本身存在染色體的平衡易位,其后代則會有幾率遺傳到異位染色體而造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。臨床染色體檢測的方法很多,如核型分析,基因芯片等,但復(fù)雜的實驗操作和昂貴的價格使得這些技術(shù)在當(dāng)前無法廣泛應(yīng)用。
近期,發(fā)表在Prenatal Diagnosis的一篇論文讓介紹了一種新的方法(CNVplex®)用于基因組全部24條染色體(22條常染色體和2條性染色體)的倍性檢測,揭示自發(fā)性流產(chǎn)是否由染色體異常引起。同時,這種方法可以檢測到染色體末端重復(fù),提示父母一方或雙方可能存在染色體平衡易位,因此需要進行核型分析,及時采取措施預(yù)防流產(chǎn)的再次發(fā)生。在檢測準(zhǔn)確性上,CNVPlex®與基因芯片一致,但成本卻是后者的十分之一。
天昊研發(fā)團隊已經(jīng)將這種技術(shù)轉(zhuǎn)化為適用于臨床的染色體非整倍檢測試劑盒,方便快捷的對流產(chǎn)原因進行排查,減輕孕婦心理負(fù)擔(dān),提供遺傳學(xué)信息從而輔助臨床醫(yī)生提出合適的指導(dǎo)方案。天昊同時提供對流產(chǎn)組織樣本以及母親基因組DNA進行個體鑒定(STR分析),排除可能的母系污染,大大加強了結(jié)果的可信度。
至今為止天昊診斷也已持續(xù)研發(fā)多種臨床篩查和診斷的產(chǎn)品,從孕前,產(chǎn)前到新生兒覆蓋整個生育過程。其中包括孕前夫婦遺傳病攜帶者篩查,男性不育相關(guān)基因檢測,新無創(chuàng)TM產(chǎn)前胎兒唐氏綜合征篩查,遺傳性耳聾90項檢測,新生兒遺傳病篩查,以及高發(fā)單項遺傳病檢測項目(如地貧,DMD,成骨不全,X脆性綜合征等)。天昊診斷一直致力于創(chuàng)新基因檢測科技,實現(xiàn)科研向臨床的轉(zhuǎn)化,以更好的防治出生缺陷,守護人類健康。
下面小編帶大家回顧這篇研究,了解CNVplex®在其中的表現(xiàn)。
A copy number variation genotyping method for aneuploidy detection in spontaneous abortion specimens
一種用于散發(fā)性流產(chǎn)產(chǎn)物的染色體非整倍體篩查方法
Prenatal Diagnosis
3.043
上海交大醫(yī)學(xué)院,國際和平婦幼保健院
CNVplex®和aCGH
研究者在24條染色體的的著絲粒兩側(cè)以及端粒附近設(shè)計探針,平均每條染色體覆蓋5-8對,共計170對(探針分布如下圖: 其中1-12號染色體,16和17號染色體有8對探針;18-20號染色體,X染色體上各有7對探針;13-15號染色體,21-22號染色體及Y染色體上各有5對探針),用以檢測每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況。因此CNVplex®不僅可檢測24條染色體的數(shù)目異常,對于染色體的末端缺失或重復(fù)的情況也可以進行檢測。
染色體的異常,如染色體非整倍體已被證明是引起自發(fā)性流產(chǎn)的最主要原因,但對于流產(chǎn)的遺傳學(xué)原因的分析,臨床上并沒有廣泛開展。對流產(chǎn)物進行染色體非整倍體的檢測有助于揭示流產(chǎn)的病理。在這項研究中,我們使用一種高通量連接探針擴增法(High-throughput Ligation-dependent Probe Amplification ,HLPA)商業(yè)名CNVplex®,檢測流產(chǎn)物中24條染色體的倍性信息,并驗證此方法在其中的表現(xiàn)(有效性及準(zhǔn)確性)。
首先,研究者對23個正常DNA樣本進行拷貝數(shù)的檢測,得到了正常樣本(拷貝數(shù)為2)的拷貝數(shù)值分布。下圖(Figure 2)為23個正常對照樣本的拷貝數(shù)結(jié)果(分布在24條染色體的170個探針上),可見拷貝數(shù)的范圍落在1.6-2.4之間(虛線)。所有對照樣本的拷貝數(shù)平均值為1.990 (s.d. = 0.131) 。根據(jù)所得結(jié)果研究者定義其值大于2.5為目標(biāo)區(qū)段的拷貝增加,低于1.5為拷貝缺失。具體為數(shù)值在 2.5-3.5提示檢測樣本為三體,0.5-1.5 提示為單體,對于嵌合體(樣本中部分細胞正常,部分為非整倍體的現(xiàn)象), 研究者通過三個連續(xù)探針拷貝數(shù)在2.3-2.5之間或者在1.3-1.5之間為標(biāo)準(zhǔn),提示樣本可能為三體嵌合或者單體嵌合。為了確診待測樣本是嵌合體還是母系污染,需進行FISH檢測或者STR分析。考慮到操作簡便,且成本較低,研究者選擇了STR分析對母親和胎兒的DNA進行鑒定以排除母血污染。
Figure 2. 23個正常對照樣本在170個探針位置相應(yīng)拷貝數(shù)值
注:盒型圖代表23個樣本在此位置的拷貝數(shù)中位數(shù)以及閾值范圍,Y染色體的拷貝數(shù)結(jié)果只統(tǒng)計了男性樣本
本研究通過HLPA和aCGH分別檢測98例自然流產(chǎn)組織中染色體拷貝數(shù)情況,并對兩種方法的結(jié)果進行了比較,發(fā)現(xiàn)中HLPA方法檢測得到的結(jié)果與aCGH完全一致,其中Figure 3A展示了其中一例樣本,aCGH和HLPA都清晰的顯示胎兒為2號染色體三體。
98例樣本中49例被檢測到為染色體非整倍體,我們對染色體變異的類型進行了統(tǒng)計:包括2號染色體三體異常3個,3號染色體三體異常1個,6號染色體三體異常1個,8號染色體三體異常1個,9號染色體三體異常1個,10號染色體三體異常1個,11號染色體三體異常1個,12號染色體三體異常1個,13號染色體三體異常1個,14號染色體三體異常1個,15號染色體三體異常2個,16號染色體三體異常15個,19號染色體三體異常1個,10號染色體三體異常2個,21號染色體三體異常3個,22號染色體三體異常2個,X單體異常9個。16號三體為本研究檢測到最多的染色體數(shù)目異常(30.6%),這與之前的研究是一致的。
對樣本7120177(編號)而言,aCGH顯示其在2號染色體上Cy5/Cy3 熒光比例上升,但并不顯著 (Figure 3B). 相同的, HLPA檢測結(jié)果顯示靶定在2號染色體的8個探針拷貝數(shù)的平均值僅為2.51(分別為2.35, 2.62, 2.66, 2.40, 2.45, 2.47, 2.72 和 2.40),其中3 個連續(xù)探針拷貝數(shù)在2.3-2.5之間。這些結(jié)果提示樣本7120177 可能為嵌合體。
Figure 3.待測樣本 7120158 (A)和7120177 (B) 分別運用aCGH和HLPA得到的拷貝數(shù)結(jié)果
注:X軸代表各染色體(chr1-chr22,X,Y),aCGH中Y軸的值為 log2(Cy5/Cy3) (待測樣本與正常男性樣本的熒光比值). 數(shù)值超過綠色的線或者低于紅色的線分別代表待測樣本為三體或者單體。在HLPA檢測中,Y軸代表所計算出的拷貝數(shù)數(shù)值,黃線之間的為正常樣本拷貝數(shù)(2)的范圍
(B) 待測樣本7120177, aCGH檢測結(jié)果顯示2號染色體熒光信號有輕微上調(diào),HLPA檢測結(jié)果顯示2號染色體拷貝數(shù)平均值為2.51,均提示該樣本為嵌合體或被污染。
對待測樣本7120177進行了Short tandem repeat (STR) 鑒定 , 以確認(rèn)是樣本本身是嵌合體或外源DNA污染導(dǎo)致。結(jié)果見表1。研究者發(fā)現(xiàn)此樣本在所有STR位點只顯示2個等位基因,因此樣本并沒有被外源DNA污染,從而確定其為2號染色體三體的嵌合體。
表1:樣本7120177 STR 檢測結(jié)果
染色體核型分析是診斷染色體異常最經(jīng)典的方法,它可以檢出染色體數(shù)目異常以及大于4Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常,但需要活細胞培養(yǎng),操作繁瑣,且費時(約10天左右);其他的技術(shù)如SNP芯片,aCGH,NGS法等,性價比都不高,也不適用于普遍快速篩查,而像FISH,MLPA等技術(shù)的限制性在于其通量不高,與這些技術(shù)相比,HLPA(CNVplex®)延續(xù)了MLPA的特點,特異性強,檢測波動小(<10%)。
染色體核型分析是診斷染色體異常最經(jīng)典的方法,它可以檢出染色體數(shù)目異常以及大于4Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常,但需要活細胞培養(yǎng),操作繁瑣,且費時(約10天左右);其他的技術(shù)如SNP芯片,aCGH,NGS法等,性價比都不高,也不適用于普遍快速篩查,而像FISH,MLPA等技術(shù)的限制性在于其通量不高,與這些技術(shù)相比,HLPA(CNVplex®)延續(xù)了MLPA的特點,特異性強,檢測波動小(<10%)。
這一體系通過參照位點檢測拷貝數(shù),所以不適合檢測多倍體,這與MLPA、aCGH是一樣的;文章中使用的探針組分辨率有限,不能檢測染色體微缺失微重復(fù)或者平衡易位的情況。此外,這一技術(shù)本身無法排除外源DNA的污染,所以需要使用STR分析排除可能的母血污染(尤其當(dāng)核型為46,XX時)。但是,CNVplex®本身的高準(zhǔn)確性以及低成本,使得它非常適用于自發(fā)性流產(chǎn)的臨床普篩。
天昊診斷自創(chuàng)立之初堅持以技術(shù)創(chuàng)新作為公司發(fā)展核心動力,基于目前國際流行的基因檢測平臺開發(fā)了多項創(chuàng)新技術(shù),其中包括AccuCopy®多重基因拷貝數(shù)檢測技術(shù),CNVPlex®高通量基因拷貝數(shù)檢測技術(shù),iMLDR®多重SNP及突變分析技術(shù),SNPscan®高通量SNP及突變分析技術(shù),EasyTarget®多重基因片段快速富集技術(shù), SNPseq®超高通量SNP及突變分析技術(shù),CNVseq®超高通量基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)等具有國際水平的專利技術(shù),希望通過自主研發(fā)的創(chuàng)新技術(shù)促進國內(nèi)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)遺傳研究以及人類各種疑難疾病的致病機理的探索,同時利用這些技術(shù)開發(fā)適合臨床應(yīng)用的各類基因檢測產(chǎn)品,服務(wù)于我國人民大眾的健康事業(yè),同時還致力于科研相關(guān)試劑的研制與開發(fā)工作。因此,公司始終將"創(chuàng)新基因科技,守護人類健康"作為公司長期發(fā)展的核心理念。