天昊CNVplex®應(yīng)用于脊髓性肌萎縮癥（SMA）臨床診斷的評(píng)價(jià)

下面小編帶大家回顧這篇研究，一起探討究竟哪個(gè)是用于臨床SMA診斷的最優(yōu)方案。

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室副教授- 李亮在“中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十五次全國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議”做相關(guān)介紹

  英文題目

Evaluation and comparison of three assays for molecular detection of spinal muscular atrophy

  中文題目

三種用于脊髓性肌萎縮癥的分子診斷方法的評(píng)價(jià)和比較

  期刊名

Clin Chem Lab Med  IF: 3.009

  發(fā)表時(shí)間

2016.10

  單位

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

  方法

qPCR,MLPA, CNVplex
1.SMN1，SMN2和NAIP基因的拷貝數(shù)通過qPCR，CNVplex®技術(shù)進(jìn)行檢測。
2.通過與MLPA的比對(duì)，對(duì)上述兩種方法的重復(fù)性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

  探針分布

多重q-PCR方法（Figure 1 A）共設(shè)計(jì)4對(duì)探針，分別是用來擴(kuò)增SMN1的第7號(hào)外顯子（141bp），SMN2的第7號(hào)外顯子（71bp），NAIP的第5號(hào)外顯子（123bp）以及reference序列 。

MLPA（Figure 1B）試劑盒共設(shè)計(jì)37對(duì)探針，其中15對(duì)位于SMA相關(guān)基因上，22對(duì)位于對(duì)照區(qū)域。

CNVPlex^®（Figure 1C）試劑盒共設(shè)計(jì)74對(duì)探針，其中41對(duì)為SMA相關(guān)基因特異性探針，33對(duì)位于不同染色體的對(duì)照區(qū)域。其中41對(duì)特異性探針中，26對(duì)位于SMN1和SMN2的第1，2a，2b，3,4,5,6,7,8外顯子，4對(duì)特異性的位于SMN1和SMN2的7,8號(hào)外顯子，5對(duì)設(shè)計(jì)于NAIP的第5.6號(hào)外顯子，還有5對(duì)位于SMA相關(guān)基因的flanking區(qū)域。

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)主要由于SMA相關(guān)基因的缺失導(dǎo)致的，此研究的目的是通過SMA相關(guān)基因劑量實(shí)驗(yàn)對(duì)SMA做出分子學(xué)診斷，并評(píng)估三種方法的可行性與優(yōu)勢所在。

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy，SMA)是較常見的常染色體隱性遺傳病，也是一組兒童期僅次于DMD，居第二位的常見神經(jīng)肌肉病，發(fā)生率約為1/6000~1/10000活產(chǎn)兒，人群攜帶率為1/40~1/50。主要表現(xiàn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性四肢和軀干肌肉無力、萎縮，重癥患兒常死于呼吸衰竭。根據(jù)發(fā)病年齡和進(jìn)程，SMA可分為四型：嬰兒型（SMA I型）,中間型 （SMA II型）,少年型（SMA III型）,和成年型(SMA IV型)。

SMA的致病基因?yàn)槲挥?q13.2的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)存活基因(SMN)和神經(jīng)元凋亡抑制蛋白基因(NAIP)。其中SMN基因在人類基因組中是兩個(gè)高度同源的基因，即SMN1和SMN2，這兩個(gè)基因串聯(lián)排列在染色體上，只有5個(gè)核苷酸位點(diǎn)的差異。SMN1是主要的功能基因，SMN2在同一個(gè)染色體上可有多份拷貝。約94%的SMA患者是SMN1基因7外顯子拷貝的缺失導(dǎo)致，SMN2基因c804 C>T的堿基變異破壞了SMN2基因外顯子剪接增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致約90%的SMN2 pre-mRNA外顯子7被錯(cuò)誤剪接掉，最終編碼出不穩(wěn)定、易被降解的截短蛋白(SMNΔ7)，約10%SMN2可以表達(dá)少量全長有功能的SMN蛋白，因而SMN2基因拷貝數(shù)與SMA的疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)：SMN2基因拷貝數(shù)在SMA I型患兒中多為2拷貝，在SMA II、III型患兒中多為3~4拷貝，SMA IV型患兒中多大于4拷貝。神經(jīng)元凋亡抑制蛋白基因(NAIP)也位于5q13.2，NAIP的缺失主要在SMA I型中被發(fā)現(xiàn)，盡管NAI     P導(dǎo)致SMA機(jī)制不是很清楚，研究發(fā)現(xiàn)NAIP的5,6外顯子缺失可能與SMA表型有關(guān)。NAIP也有兩個(gè)倒位重復(fù)基因，其中一個(gè)可產(chǎn)生有功能的基因（Figure 2）。

Figure 2.選自<臨床遺傳咨詢>

SMA不同基因型的組合：多數(shù)SMA I型病人的基因型多為B-1或B-2所示的缺失純合子，SMA II型,III型的基因型為B-3或B-4的純合子或雙重雜合子，無癥狀SMA攜帶者只有一個(gè)SMN1拷貝，同時(shí)帶有0-4個(gè)SMN2拷貝。

拷貝數(shù)定量

多重q--PCR,MLPA,CNVPlex^®三種方法目的區(qū)域（SMA相關(guān)基因）的拷貝數(shù)（0，1，2，3）由不同的比值決定（Figure 3）。

多重q-PCR是 2 − ΔΔCq 值決定基因拷貝數(shù)： 2^− ΔΔCq < 0.30 for 0 copies, 0.40~0.70 for one copy, 0.75~1.30 for two copies, 1.35~2.0 for three copies, and > 2.0 for four copies。

CNVPlex^®的拷貝數(shù)與結(jié)果比值范圍： ratio < 0.10 for 0 copies, 0.20~0.70 for one copy, 0.75~1.30 for two copies, 1.35~1.80 for three copies, and > 1.80 for four copies.  Similar to MLPA assays。

結(jié)果超出以上范圍的樣本需重新檢測。

重復(fù)性分析

    30個(gè)樣本SMN2基因的拷貝數(shù)檢測用來評(píng)估三種方法的重復(fù)性，結(jié)果表明：

1.同一種檢測方法不同次數(shù)之間并沒有顯著性的差異（Table 2）；--重復(fù)性好

2.不同檢測方法之間的結(jié)果存在顯著性差異（p<0.05）（Table 3）；

3.在檢測SMN2拷貝數(shù)的結(jié)果比值中，CNVPlex^®的結(jié)果明顯更接近理論值；

4.在檢測SMN2基因1拷貝的實(shí)驗(yàn)中，CNVPlex^®的結(jié)果比值明顯小于q-PCR((0.49 ± 0.06 vs. 0.62 ± 0.04, p = 9.46 × 10⁻⁹)和MLPA（(0.49 ± 0.06 vs.0.60± 0.06,p =2.8 × 10⁻⁷），而在q-PCR和MLPA方法之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。檢測 SMN2基因2拷貝時(shí), MLPA 的結(jié)果比值明顯高 CNVPlex^®(1.08 ± 0.07 vs. 1.03 ± 0.05, p = 0.007)或qPCR assays (1.08 ± 0.07 vs. 1.03 ± 0.04, p = 0.011)，而在q-PCR和CNVPlex^®方法之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。檢測 SMN2基因3拷貝的實(shí)驗(yàn)中，MLPA結(jié)果比值明顯低于CNVPlex^® (1.42 ± 0.08 vs. 1.50 ± 0.09, p = 0.007)，其他無顯著性差異。

特異性與靈敏度分析

    為了測試q-PCR與CNVPlex^®方法的特異性和靈敏度，研究者對(duì)應(yīng)用于317個(gè)臨床樣本的2種方法的結(jié)果與MLPA的結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，SMN1，SMN2和NAIP基因的結(jié)果均沒有超出閾值范圍的（figure 4），且基因劑量的結(jié)果（TABLE 4）展現(xiàn)了100%的診斷準(zhǔn)確率。

兩種方法的準(zhǔn)確率均達(dá)到的100%，相比較而言，qPCR的可重復(fù)性高（組內(nèi)CVs：3.01%~8.52% ，組間CVs：4.12%~6.24%），CNVPlex^®的得到的結(jié)果更接近理論值（0.49~0.5 for one copy, 1.03~1.0 for two copies, and 1.50~1.50 for three copies）。

總的來說，多重q-PCR是一種簡單，快速，高性價(jià)比的方法，適用于常規(guī)的SMA診斷以及攜帶篩查，而CNVPlex^®的靈敏度很高，檢測值更接近理論值，還可用于診斷攜帶SMAs復(fù)雜基因結(jié)構(gòu)的特殊病例。兩種方法都是非?？煽康?，并適用于SMA臨床診斷。

從花費(fèi)和耗時(shí)角度來說，q-PCR是最經(jīng)濟(jì)的且耗時(shí)最短的方法，約花費(fèi)0.8美元，需要2.5h。MLPA花費(fèi)較高，約10.5美元，需要22h完成實(shí)驗(yàn)。所以說q-PCR是檢測SMA最快速，準(zhǔn)確，最具性價(jià)比的方法。但q-PCR和MLPA方法的限制性就在于通量低，只能單次檢測一到十幾個(gè)目的區(qū)域的拷貝數(shù)檢測。

而SMA相關(guān)的基因都處在染色體不穩(wěn)定區(qū)域，其他的變異以上的兩種方法都不能檢測到，如之前在SMA病患中發(fā)現(xiàn)的SMN1基因的1-6外顯子的缺失雜合突變。CNVPlex^®的體系包括41對(duì)特異性探針，覆蓋SMN1，SMN2的所有外顯子，及NAIP的第5.6號(hào)外顯子，就可以檢測到所有探針?biāo)谖恢玫目截悢?shù)變化，這對(duì)診斷SMA的稀缺病患的復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異是十分重要的。

CNVplex^®的優(yōu)勢在于：

通量高：可同時(shí)實(shí)現(xiàn)48-480個(gè)區(qū)段拷貝數(shù)快速檢測，檢測效率大大增加。
準(zhǔn)確性高：基于高特異性的連接原理，檢測區(qū)域連接產(chǎn)物采用通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增效率基本一致，平均檢測CV<10%。
分辨率高：可對(duì)6拷貝以內(nèi)的片段進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
重復(fù)性高：檢測穩(wěn)定性高，節(jié)約樣品復(fù)孔的檢測費(fèi)用。
快速高效：使用的探針短，可以直接合成，無需克隆制備，更快。

天昊診斷自創(chuàng)立之初堅(jiān)持以技術(shù)創(chuàng)新作為公司發(fā)展核心動(dòng)力，基于目前國際流行的基因檢測平臺(tái)開發(fā)了多項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)， 其中包括AccuCopy^®多重基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)，CNVPlex^®高通量基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)，iMLDR^®多重SNP及突變分析技術(shù)，SNPscan^®高通量SNP及突變分析技術(shù)，EasyTarget^®多重基因片段快速富集技術(shù)， SNPseq^®超高通量SNP及突變分析技術(shù)，CNVseq^®超高通量基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)等具有國際水平的專利技術(shù)，希望通過自主研發(fā)的創(chuàng)新技術(shù)促進(jìn)國內(nèi)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)遺傳研究以及人類各種疑難疾病的致病機(jī)理的探索，同時(shí)利用這些技術(shù)開發(fā)適合臨床應(yīng)用的各類基因檢測產(chǎn)品，服務(wù)于我國人民大眾的健康事業(yè)，同時(shí)還致力于科研相關(guān)試劑的研制與開發(fā)工作。因此，公司始終將"創(chuàng)新基因科技，守護(hù)人類健康"作為公司長期發(fā)展的核心理念。

Reference：Li L, Zhou W J, Fang P, et al. Evaluation and comparison of three assays for molecular detection of spinal muscular atrophy[J]. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 2016.